慢性弓形虫感染与正常大鼠海马的比较蛋白质组学研究.pdfVIP

的亲嗜性，弓形虫速殖子在不同器官分裂繁殖后可以形成包囊，长期寄生在脑部，形成一种慢性感 染，这是一种主动免疫和寄生虫免疫逃避之间的动态平衡。星型胶质细胞和神经元细胞等不同脑细 胞都可以被寄生虫感染。因此中枢神经系统是最常受隐性弓形虫病的影响，这种感染在一定程度上 可能加重了隐性弓形虫病患者的心智发展，具体表现为心理活动(精神运动)，它们的学习能力和 记忆力下降、反应时间显著延长u卜13j。大、小鼠的实验研究也证实弓形虫感染可能改变宿主的行为 和神经递质功能【l引，感染损害了大、小鼠的运动功能以及学习和记忆能力、对新环境的适应能力下 降【l量161；人类宿主也有间接证据表明弓形虫隐性感染对人格产生变化【l7-19]。海马是大脑边缘系统的 一个重要组成部分，目前认为海马是脑内与学习和记忆功能关系最密切的部位之一，同时海马也是 参与下丘脑．垂体肾上腺(HPA)轴负反馈调节的高位中枢，同其它脑区相比，海马神经元脆性大， 易受损伤。我们前期的研究已从行为学角度证实了弓形虫慢性感染大鼠的Morrs水迷宫测试成绩下 降，对学习记忆能力造成损害【9l01。弓形虫慢性感染致海马结构与功能的损伤或许是一个极为复杂 的生物学过程，可能涉及到多种蛋白质表达的变化及由此引起的生物化学反应和信号传导的改变。 蛋白质组学技术是利用双向电泳对组织进行大规模蛋白分离，然后应用质谱技术对分离的差异蛋白 进行鉴定，通过比较正常与疾病组织的差异表达蛋白，寻找疾病相关蛋白质。蛋白质组学方法的出 现，使得在整体上、高通量筛选不同生理和病理过程中差异表达的蛋白质成为了可能。为此本研究 以弓形虫慢性感染大鼠海马作为研究对象，应用双向凝胶电泳结合质谱鉴定的方法，对其进行分析 比较，寻找海马中与学习记忆相关的蛋白，为研究弓形虫感染致学习记忆能力影响机制及发现新的 药物靶标奠定基础。 1材料与方法 1．1试剂、仪器和实验动物 1．1．1试剂与仪器7 二烷基硫酸钠(SDS)、甘氨酸等双向电泳试剂均购自Amershampharmacia公司；考马斯亮蓝R．250 Pharmacia IIxi 聚焦仪，图像扫描仪及PDQuest1．0图像分析软件(AmershamBiotech公司)；PROTEN Power 垂直电泳仪，ElectrophoresisSuppIy2EPS601(B 公司REFLEXIII基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD12TOF2MS)仪． 1．1．2弓形虫速殖子的制备和纯化取弓形虫国际标准株(RH株)感染72h的小鼠腹水，洗涤3 次，过CF．1l纤维素柱，滤液离心，用灭菌的生理盐水调节弓形虫速殖子密度。 1．1．3实验动物与分组 10只雄性Wistar清洁级大鼠，体重(200 a：20)g，南京军区动物实验中心 7／mLRH株弓形虫速殖子悬液各2 组每只大鼠腹腔注射上述纯化的2×10 mL，对照组每只大鼠腹腔注 射灭菌生理盐水2mL。所有动物均饲养于江苏省寄生虫病防治研究所动物实验中心(编号 及饲料经高温蒸汽灭菌。 1．2实验方法 1．2．1海马组织2-DE蛋白样品的提取及定量弓形虫感染10周后将大鼠快速断头处死后迅速取出大 Inhibitor buffer，Protease DTT,0．2％(w／v)IPG PMSF,1mg／mlDNaseI)，采用超声破碎与液氮冻融相结合 000 的方法提取蛋白，4℃离心(15g，45min)，用Bradford法对提取的蛋白质进行蛋白浓度测定，分 装后于．80℃保存备用。 1．2．2双向凝胶电泳参考IPGphorTM等电聚焦系统操作指南，将2 mg海马组织蛋白与水化液(8 Inhibitor mmol／L buffer，Protease