实时荧光定量聚合酶链反应原理和在预防兽医学中的应用及研究进展.pdfVIP

维普资讯 中国动物检疫 2008年第 25卷第 7期 嘲 一56一 文章编号 ：1005—944X(2008)07—0056—02 实时荧光定量聚合酶链反应原理和 在预防兽医学中的应用及研究进展 曹军平 刘秀梵 (扬州大学兽医学院畜禽传染病农业部重点开放性实验室 江苏 扬州 225009) 聚合酶链反应 (PCR)是检测核酸 测和监测病原微生物感染 的最重要 一 个或两个荧光标记寡核苷酸探针． 的强力方法 由于 PCR技术简便易 技术。事实上．监测病毒负荷和病毒 最常报道的进行病毒检测的诊断方 行、灵敏度高等优点，该技术被广泛应 增殖 的动力学可估测病程及预后相 法 根据探针化学可分成不 同的类 用于基础研究．成为分子生物学必不 关性，因此 ．定量病毒检测对临床病毒 型：水解探针 (HydrolysisDrobes)、杂 可少的研究工具 由于传统的 PCR 感染监测具有重要意义 ．现 已建立 了 交探 针 (Hybridization probes)、分 子 技术存在不能准确定量．且操作过程 一 些病毒 的量化指标作为临床诊断 信标。其中水解探针方式最常用。如： 中易污染而使得假 阳性率高等缺点． 的补充 。可以预料 ．诊断实验室将继 TaqMan或 5核酸探针 ．能与靶核苷 使其应用受到局限。对 PCR产物进 续发展许多临床有关病原微生物 的 酸特定结合．双重标记．5共价连结 行准确定量成为 PCR技术发展 的重 量化 目标 。 荧光报告染料 (如：FAM 或 VIC)．3 要 方 向 。定 量 PCR (quantitative 1 检测原理和模式 共价连结荧光淬灭染料 f如：TAM— PCR，Q—PCR)先后 出现 了多种方法， 分为 2类 ：一类无靶专一性探针： RA)。根 据共 振 能 量转 移原 理 ．在 目前为止．其 中结果最为可靠 的就是 二类有靶专一性探针。前者包括嵌入 PCR反应 中．当引物延伸时 ．杂交探 实时荧光定量 PCR(RQ—PCR)。 染料或 DNA结合染 料如溴化 乙锭 针被 Taq酶 的5核酸外切酶活性剪 实时 PCR技术 比起普通 PCR． (EtBr )、YO—PRO1、SYBR Green I、 切．探针两端的荧光报告和淬灭基 团 不用进行琼脂糖凝胶 电泳 、EB染色 、 BEBO等．非特异地与双股 DNA分子 分开．报告基 团开始释放荧光并可在 人工分析数据等步聚 较之与 以前 的 结合 ．在适当的光源激发下放出荧 每个延伸阶段末被测量 在优化 的试 以终点数据分析为基础 的终点定量 光。在 PCR退火和延伸步骤 ．越来越 验 中．释放荧光量和PCR每个循环合 聚合酶链反应 (end-pointquantitative 多的染料结合新合成 DNA双链 ．在 成 的扩增子数量有线性相关关系 ．并 PCR)有很大的优势。它操作简便 、快 伸长阶段结束时发射 出最大荧光 变 可 以此为基础计算模板 的初始拷 贝 速高效．具有很高的敏感性和特异性． 性阶段染料再次释放到溶液 中．进而 数 。主要优点包括探针设计简易 据 可降低污染．还可进行多重扩增 荧光量减少 在 PCR每个循环的伸 报道有 80％的成功率．不需熔解 曲线 RQ—PCR量化靶序列是建立在 长 阶段末尾记录荧光量 ．反 映 了扩增 分析，特异性较好 。缺点是延伸温度降 连续测量扩增过程 中荧光信号的积 产物 的数量。如果起始模板数 已知．我 低，对 Taq酶的加工活性和扩增效率 累或减少基础上 的 与终点定量 PCR 们就可以对靶序列进行绝对定量 有影响．价格较 昂贵 另一种经常用来 相 比 RQ—PCR技术可以实时检测每 相对于其他 的实时检测方式 ．该 检测 DNA病毒 的方式是杂交探针 个扩增循环产生的扩增子数量f动态 方法更容易建立和便宜 ．因为不需靶 这种方法基于引物扩增片段 间两个 定量聚合酶链反应 kineticquantita— 专一性荧光探针 。此外 ．信号强度与 与其杂交的相邻寡核苷酸探针．其一 tivePCR)。这一技术不需要样 品的扩 量化结果不受靶序列 内部突变所影 在 3标记供体染料 (如发绿色荧光)． 增后处理 ．为实现全 自动化检测铺平 响．这可能有利于在 PCR 中分析有较