大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为表皮细胞及皮损修复的实验研究.pdfVIP

of ·421· 中国实验血液学杂志JournalExperimentalHematology2011增刊 2天后半量换液，4天时完全换液，弃去未贴壁细胞， 胞即为MSCs，此细胞形态长梭形，类似成纤维细胞， 贴壁细胞继续培养，以后每2—3天换液1次，14天后当呈团、簇状分布。14天时细胞贴满瓶底，此时呈鱼群 细胞融合达80％左右时，用胰蛋白酶消化传代。定期观 样、漩涡状、辐射状或网状排列。传代后细胞增殖迅 察细胞的生长情况，细胞传至第4代后用流式细胞仪分 速，一般2-3天可传一代。流式细胞术分析MSCs结果 析CD34、CD29、CD90、CD45的表达情况，从而鉴 定间充质干细胞。2．MSCs诱导分化成表皮细胞及其鉴性、CD45表达阴性。2．表皮细胞的鉴定：经20％的烧 定：将第4代细胞按106的密度接种于6孔培养板中，用伤大鼠血清诱导MSCsl4天后，用流式细胞仪检测细胞 含20％的烧伤大鼠血清的DMEM—F12培养基孵育，每角蛋白(cytokemtinCK)Ij日性细胞即表皮细胞的表达率为 3-4天换液一次，当细胞达至1J90％融合时，用胰蛋白酶7．22％，而未经诱导的cK阳性细胞的表达率为0．23％。 消化传代，于第14天用免疫细胞化学染色及流式细胞 同时，按免疫组化方法染色，检测胞浆呈棕黄色的CK 阳性细胞即为表皮细胞。3．创面观察：术后两组创面均 仪检测细胞角蛋白(cK)IjH性细胞即表皮细胞的表达情 况。3．动物移植实验：动物模型制备及诱导后的MSCs较干燥，面积逐日缩小，无明显感染征象．术后第14天创 与未经诱导的MSCs回植选取24只健康Wistar大鼠，面平均收缩率在各两组间(A组与c组、B组与c组)均 平均体重为2009，雌雄各半，分为三组，每组八只， 有显著性差异，而两治疗组间(A组与B组)差距无显 著性沧0面平均愈合时间在各两组间(A组与c组、B组 即治疗组A(诱导组)、治疗组B(未经诱导组)和对照组C (f6MSCs移植组)；大鼠背部正中线处，各制造直径约与c组)均有显著性差异，而两治疗组间(A组与B 为5cm的圆形全层皮肤缺损创面，立即以I型胶原为载 组)无显著性差异。4．MSCs单独或与诱导剂组合移植 体，将BrdU标记的自体MSCs及含有经诱导的MSCs分别皮肤再生作用比较：(1)常规病理学观察：在第4周三 单次涂布到治疗组A、B的创面上，而对照组c组仅在创 组再生皮肤病理切片中，治疗A、B组再生皮肤附件明显 面上涂布I型胶原，各组创面上均敷凡士林纱布，然后采 丰富，表皮细胞数目显著增多，细胞层次增多，表皮层明 用打包法进行缝合固定后单笼饲养。4．创面观察接种 显增厚。(2)免疫组织化学染色结果：在第4周治疗A、 后，切观察创面情况，于术后第14天将创面大小描印于无 B组再生皮肤组织切片中均可见BrdU染色阳性细胞，阳 菌透明薄膜上，按公式计算创口收缩率，记录治疗组和对 性细胞多位于皮肤附件毛囊内层上皮根鞘以及再生表 照组愈合时间。创口收缩率(蛳=闭合创面面积／原创 皮的基底层、棘层，在形态学上此类细胞呈立方形或多 面面积×100％。5．病理学及免疫组织化学染色检查 边形，与周围表皮细胞无明显差异，且叮见其相邻生长。 于4周后选择实验动物，取创面中央直径1cm范围的皮肤， 结论：1．骨髓间充质千细胞经烧伤大鼠血清诱导 制成石蜡切片，用苏木精一伊红染色法(HE染色)染色， 后，可以向表皮细胞方向分化，说明骨髓间充质干细 光镜下观察皮肤结构。同时，连续切片，采用SABC免胞在特定诱导剂作用下，具有向外胚层组织细胞分化 疫组化检测。严格按博士德公司试剂盒说明书操作，二 的潜能。2．无论是Mscs单独移植还是与必要的诱导剂 氨基联苯胺(DAB)显色。鼠抗Brdlu单克隆抗体(北京中组合移植其皮肤的修复与再生情况都超过大鼠皮肤自 衫金桥生物公司)工作浓度1：100，二抗羊抗鼠抗体工作然愈合，且不仅皮肤再生快，而且皮肤附件如毛囊等的再 浓度1：100。于显微镜下观察染色结果，细胞核呈棕黄 生也比对照组明显改善，为临床上MSCs用于移植治疗 色的细胞为BrdU阳性细胞。 大面积严重烧伤等疾病提供了实验