苯并(a)芘致人支气管上皮细胞DNA损伤与组蛋白H2A单泛素化水平的关系.pdfVIP

第。卜届全国环境与职业医学研究生学术研讨会论文集 ·127· 作用下16HBE细胞DNA损伤水平与组蛋白H2A单泛素化的关磨砂玻片上铺第一层胶；4℃使其凝固；取80止37℃的0．5％ 系，为探讨组蛋白H2A在DNA损伤修复过程中的作用及其机低熔点琼脂糖(LMPA)和20uL细胞充分混匀，迅速铺第二层 制提供依据。 胶；样本放入新鲜配制的冰凉细胞溶解液(贮备液2．5mol／L NaCl，100mmol／LNazEDTA，10mmol／LTris，pHlO，临用前加 l材料与方法 1．1主要试剂与仪器 片，PBS清洗两次，除去表面附着的细胞裂解液；置于解旋液 MEM(minimumessentialmedium)培养基，Gilmo公司；胰 calf serum)，cibco将玻片移至盛有新鲜冰冷电泳缓冲液(O．3mol／LNaOH，lmmol／L 酶(Trypsin)，AlnTeseo公司；血清(newborn 公司；低熔点琼脂糖(10w 13)的水平电泳槽，开启电源，定电压25V，调 meltingpointagarose)，北京拜尔NazEDTA，pH 迪生物公司；正常熔点琼脂糖(豫gtll盯agcalOSeG-IO)，GENE Histone 将载玻片转移至中和缓冲液(0．4mol／L 7．5)中，浸洗 companyLTD；Anti-UbiquitylH2A．X(Lysl19)，MiHipore Tfis，pH 公司；苯并芘(3，4-Benzopyrene)，Sigma公司，批号WUD5H；样本3次。每次5rain；晾干后滴加浓度为0．5pg／mL的溴化乙 二甲基亚砜(DMSO)，soLARBl0公司；高灵敏度化学发光检 啶约50“【／片染色，盖上玻片，荧光显微镜下观察，每个样本 测试剂盒，北京康为世纪公司。二氧化碳培养箱，德国Heraetm 公司；sw．CJ．2F型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；单细胞凝胶电泳分析软件进行彗星图像分析，计算各组彗星的 LS-B50L立式压力蒸汽灭菌器，江阴滨江医疗设备厂；Neofuge 15R台式高速冷冻离心机，上海立申科学仪器有限公司； 头光密度中心)。 1．2．4 ABl04-N电子天平，上海电子仪器厂；WD-9405A型脱色摇床， mol／L mol／L Basic型电泳仪，BIO-RAD公司；细胞。用裂解液(0．1 NaCl，0．01 7．6， 北京六一仪器厂；Powerpoe TridHCI，pH 1mmol／L 超低温冰箱，中科美菱公司；OlympusBX-51荧光显微镜，日本 EDTA，pH8．0，100舭PMSF，2tw,／皿LLeupeptin)， Olympus公司。 1．2方法 1．2．1人支气管上皮细胞培养及传代人支气管上皮细胞株 测蛋白表达水平。用ECL检测蛋白质表达，胶片扫描保存。实 验重复进行3次，通过洗片机获得蛋白条带。用捷达801专业 16HBE由首都医科大学田琳教授惠赠，培养液为含10％血清 的MEM培养基。培养液中含青霉素100UImL、链霉素100U／mL，数码凝胶成像与分析系统3．3软件对Westernblot蛋白质条带 于37℃，5％C0：孵育箱中培养，3d传代1次，传代时弃去旧培进行定量，用目的蛋白，队etin的灰度值比作为目的蛋白表达