骨桥蛋白在胆固醇结石患者胆汁中的表达及成核作用研究.pdfVIP

此探讨和研究胆结石的成石机制显得尤为急迫。目前认为，胆结石的形成主要与 胆囊胆汁成分异常、胆囊病变及胆道动力学改变相关，胆囊胆汁的成分异常在其 中起了重要的作用。胆汁中存在促成核因子和抑成核成核可调节胆结石的形成， 目前已经发现了如粘蛋白、a1-酸性糖蛋白及33.5kD 等诸多具有成核活性蛋白质 [2-4] 及其他离子，但在对抑成核因子的研究和确认则较少 。骨桥蛋白（osteopontin， OPN ）是一种具有多种生物活性的低分子量糖蛋白，尽管发现骨桥蛋白在人胆囊 [5] 及胆汁中均有表达 ，但关于OPN 与胆结石形成的关系，尚未见文献报道。因 此，我们在本研究中利用成核时间（Nucleation time ，NT ）法在体外研究了OPN 在胆汁中的成核作用，并检测结石患者与正常对照人群胆汁相关成分的差异，为 研究胆结石成因提供了新的思路。 材料与方法 1.1 一般资料 主要试剂：氯化钙、人血清白蛋白、亮抑酶肽、骨桥蛋白均购自Sigma 公司， 氯霉素、依地酸钠、叠氮钠等常规试剂购自上海国药集团生化试剂厂。胆汁成分 及OPN 检测试剂盒购自RD 公司。主要仪器：0.22µm 滤膜（华美公司）、偏光 显微镜（Olympus 公司），超速低温离心机为Biofuge公司产品，恒温培养箱（复 旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系）。 1.2 临床资料 取我院普外科行择期手术的胆结石患者为实验组，对照组取自上海市第一医 院普外科及我院普外肝移植之供体，两组人群均符合下列入组标准。实验组 36 例，男 16 例，女20 例，平均年龄（44±7 ）岁，对照组19 例，其中男 11 例， 女8 例，平均年龄（42±6 ）岁，两组患者均具有可比性。结石组患者均为胆固醇 结石，结石数≧2 个。 纳入标准：① 结石中胆固醇含量均65% ；② 20 岁年龄60 岁；③ 胆囊 无急性炎症；④ 胆囊无萎缩，硬化；⑤ 对照组胆汁无胆固醇结晶；⑥肝功能指 标正常；⑦胆汁常规细菌培养结果为阴性。排除标准：① 糖尿病；② 高脂血症； ③ 恶性肿瘤；④ 心脑血管疾病；⑤ 肝肾原有疾患；⑥ 服用影响肝肾功能之药 物；⑦ 患者拒绝参与者。本研究 1.3 胆汁标本制备 [6] 胆囊胆汁按照 Strasberg 描述方法 ，每次根据具体情况取6- 10ml，将所有 胆囊胆汁分装于无菌管中，于4 ℃ 15000g 离心15min，去除组织碎片等杂质， 再加入胆汁保存液（0.05%氯霉素、3mM 叠氮钠、1mM 亮抑酶肽和5mM 依地酸 钠）置于-79℃备用。 1.4 成核时间实验[7] 分别取结石胆汁和对照胆汁 6ml，100 000g 超速离心 2h，取中间相的3ml 置于无菌玻璃罐中，然后在偏光显微镜下观察，无胆固醇结晶可用于实验，若有 胆固醇结晶则重复超速离心过程，至镜下无胆固醇结晶。以人血清白蛋白为对照 组，白蛋白、氯化钙及OPN 均溶于灭菌蒸馏水中，制成高浓度溶液，备用。 成核时间试验：分别取实验组胆汁和对照胆汁于无菌管中，37℃ 45000rpm 超速离心 30min 后，0.22µm 滤膜过滤，每管胆汁为480µl，分别加入20µl OPN， 白蛋白、氯化钙，总体积500µl 控制；置于 37℃恒温箱培养，平衡30min 后做 为实验零点，以后每24h 在偏光显微镜下观察带有折光性的胆固醇结晶析出，直 至所有标本均出现结晶，则为实验终点。记录每个样本出现胆固醇结晶的时间， 即为成核时间。 实验组分别为白蛋白（对照100µg/ml）、OPN （50µg/ml）、OPN （100µg/ml）、 氯化钙（10mmol/l）、OPN （50µg/ml）+氯化钙（10mmol/l）和OPN （100µg/ml） +氯化钙（10mmol/l）。 1.5 胆汁成分及OPN 测定 两组胆汁中胆固醇、磷脂、胆酸、钙离子及OPN 含量测定，均按试剂盒操 作说明书进行，按照胆固醇、磷脂、胆酸含量根据Carey 表格计算胆固醇过饱和 [8] 指数（cholesterol saturation index，CSI