中药五谷虫粗提物对感染创面抗菌活性的实验研究.pdfVIP

l材料与方法 1．1实验材料制备 1．1．1五谷虫的消毒处理 本实验以传统中药材五谷虫(蛆虫)中的丽蝇科丝光绿蝇幼虫为研究对象。 先用生理盐水反复冲洗，放入碘酊中浸泡5分钟后，再放入75％洒精中5分钟。将无菌棉放入 消毒好的无菌罐中，加入新开封的无菌牛奶将棉花浸湿，放入蛆虫密封好，在4℃冰箱过夜。蛆虫 将体内食物的排泄物排泄到牛奶中去，次日清晨撕开无菌棉得到蛆虫，重复开始的消毒过程。 1．1．2幼虫抗菌物质的粗提： mM mM 取适量丝光绿蝇幼虫(600条)，加入2倍体积TNE缓冲液(10 7．5，150 Tris．HCi，pH mM PMSF，3raM NaCI，5EDTA)，及蛋白酶抑制剂混合物含loI_tg／nalleupeptin，1gg／mlaprotinin，lmM 缓冲液，沸水浴2min，离·t3(12000Xg，40C，10rain)，取上清液，即为粗提物。 1．2抗菌物质生物活性测定 选择能使抗菌物产生最大抑菌斑的细菌浓度即5个OD值，30ul来铺平板，并用水解酪蛋白作 为固体培养基。将临床上从感染创面上分离出的金黄色葡萄球菌接种子培养基上，在直径为四毫米 的3个药敏片上滴加抗菌物质的粗提物。另选取3个药敏片作为对照，2个滴加幼虫匀浆上清液，1 个滴加TNE缓冲液。370C，与金葡菌共培养18小时，观察并测量抑菌圈直径。 1．3SDS．PAGE分析纯化过程中蛋白质组成的差异。 将成熟幼虫1000条滤干后加入25ml无菌水。置于室温25℃的摇床培养4h，滤出培养液，经 浓缩胶和15％的分离胶分别对幼虫匀浆上清液(未经沸水水浴)、抗菌物质粗提物和幼虫分泌物提 取液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。 2结果 2．1不同物质对金葡菌的抗菌敏感性比较(见图1)。 以金黄色葡萄球菌为指示菌时，五谷虫抗菌物质粗提物的抑菌嘲直径明显大于幼虫匀浆上清液 和TNE缓冲液的抑菌圈直径，抗菌物质粗提物经过沸水浴2min，结果显示其具有较高的抑菌活性。 2．2SDS．PAGE分析纯化过程中蛋白质组成的差异结果(见图2)。 对幼虫匀浆上清液(未经沸水水浴)、抗菌物质粗提物和幼虫分泌物提取液进行聚丙烯酰胺凝 胶电泳。显示得到的抗荫物质粗提物和幼虫分泌物提取液的蛋白质总类明显减少，并主要以小分子 量的蛋白质成分为主。 3．讨论 传统抗生索对于控制、预防和治疗各种感染性疾病发挥了重要作用。由于抗生素的使用。到20 世纪80年代，人类几乎可以征服所有的感染类疾病，然而，随着时问的推移以及人类对于抗生素的滥用。 耐药菌株愈来愈多。作为研究对象的中药五谷虫中的丝光绿蝇是一个在中医学、昆虫学、临床医学、 法医学应用较为广泛的蝇种。 】972年瑞典科学家Boman等在果蝇中发现抗苗物质，随后首次从惜古比天蚕蛹中诱导分离到 J。此物质具有分子母低、水溶性好、热稳定、强碱性和广诺抗茁等特点．井具有 升命名为cecropinP 独特的抗茁机制，仅仅作用于原梭细胞和发生病变的真核细胞，对正常真核细胞几乎没有作用，且不易 产生耐药性。因此，在耐药菌、甚至是多重耐药菌日益增多的今天，抗苗肚的开发与应用为临床抗苗药 物的开发提供了新的选择。本实验卧金黄色葡萄球菌为指示苗，五谷虫抗茴物质粗提物的抑菌圈直 径明显人于幼虫匀浆上清液和TNE缓冲被的抑菌圈直径，提示五谷虫粗提物具有较强的抗苗活性。 目前．国外对昆虫体内抗翦物质研究，认为该类抗菌物质作为一种氮基醴残基组成的小肚，可 以白名为抗茼肽类物质。这些抗苗肚都具有同样的特征：lq-：端富含碱性氨基酸，呈强碱性，C端中 性疏水性。多数抗苗肚的等电点太于7，表现出较强的阳离子特征，对较大离子强度，较低或较高 的pl-I都有较强的抗性另外部分抗菌肚尚青抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的能力”】。我们通过研究 发现，五谷虫抗菌成分对热稳定．在100摄氏度沸永中加热2rain仍能保持抗菌括力。 目前，国外有关家蝇和果蝇幼虫抗苗物质的初步纯化工作已有报道，但丝光绿蝇的抗菌物质纯 化还未见报道，然而我们经临床研究发现丝光绿蝇作为食腐败组织的蝇娄，在抗腐