牛Gtl2基因克隆及Dlk1-Gtl2印记区域在体细胞核移植牛中的DNA甲基化状态分析.pdfVIP

取得的研究 其他人已经 育机构的学 均已在论文 日 文的规定， 被查阅和借 数据库进行 月 日 Y1 89芗’4§‘1” ／㈣㈣辨Iffl 摘要 体细胞核移植技术在医疗、农业及畜牧业等诸多领域有重要的应用价值。尽管体 细胞核移植已经在多种哺乳动物中获得成功，但仍有大多数克隆动物在孕期流产，只 有少数能发育到妊娠末期或成年，即使是存活下来的克隆动物也多伴有器官发育异 常，这些制约了体细胞核移植技术的广泛应用。在体细胞核移植过程中，体细胞核放 弃已有的高度分化的体细胞模式，进行重编程形成全能性的胚胎模式，此过程称为表 观重编程。目前认为，供体核的不完全重编程导致在发育过程中有重要作用的基因异 常表达或没有表达是克隆效率低下的主要原因。DNA甲基化是基因组主要的表观修 饰模式，是调节基因组功能的重要手段，DNA甲基化的程度对基因的表达有重要的 调控作用。 基因组印记是指来自双亲的等位基因的差异性表达，即来自亲本的等位基因或染 色体在发育过程中产生专一性的加工修饰，导致后代细胞中两个亲本来源的等位基因 有不同的表达活性，具有这种现象的基因称为印记基因。Dlkl．Gtl2印记区域的印记 基因参与胚胎和胎盘的生长发育调控，该印记区域在各个物种中高度保守。目前， Dlkl．Gtl2印记区域在人和鼠中研究的比较多，由于基因序列的限制，该区域在牛中 研究的很少。 为了研究D脚．Gtl2印记区域在体细胞核移植牛中的DNA甲基化状态，首先采 用RACE方法得到了牛Gtl2基因的全序列，结果显示牛研陀基因存在可变剪切，并 且没有发现与Kozak规则相匹配的翻译起始序列，推测其可能是一种非编码的RNA。 根据NCBI上已知的牛Dlkl和已获得的牛@12 DMR和 行序列比对，确定了D脚．Gtl2印记区域在牛21号染色体上的位置以及①12 IG．DMR区域。 亚硫酸氢盐测序法是一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目的片段中每一个 CpG位点的甲基化状态。为了探求核移植过程中DNA甲基化的表观重编程是否充分， 本试验利用亚硫酸氢盐测序法分析了Gfl2 DMR甲 h内死亡的克隆牛和自然繁殖牛肺脏中的DNA甲基化状态。结果显示，Gtl2 基化程度在克隆牛和自然繁殖牛肺脏中都较高，且没有显著差异；体细胞核移植牛中 5’启动子 IG．DMR甲基化程度较低，与正常对照组相比差异显著(P0．05)；而Dlkl 区在体细胞核移植牛表现出高甲基化，与正常对照组相比差异显著俨o．05)。由此可 见，IG．DMR和Dlkl5’启动子在体细胞核移植牛肺脏中出现了甲基化重编程紊乱，这 种异常甲基化可能造成印记错误从而影响个体器官的正常发育，可能是导致克隆效率 低下和克隆动物器官发育异常的原因之一。 关键词：体细胞核移植；牛；D脚．Gtl2印记区域；DNA甲基化；DMR；启动子 ofbovineGtl2 andDNA statusof Molecular cloning gene methylation Dlkl-Gtl2 domaininclonedbovines imprinted Mastercandidate：