全人源抗肝癌fb噬菌体抗体库的建立及初步筛选.pdf

全人源抗肝癌噬菌体Fab抗体库的构建与初步筛选 摘要 目的：构建人源抗肝癌Fab噬菌体抗体库，从抗体库中筛选抗 肝癌的噬菌体Fab抗体，并对其进行初步鉴定和测序分析。 方法：体外致敏并用EBV转化肝癌患者的PBMC。用PCR分别 扩增重链Fd基因和轻链九、K链基因。将轻、重链基因先后与载体 库。用人肝癌细胞及人肝细胞对初级噬菌体抗体库进行亲和富集及 并测序。 癌细胞抗体产生，经多次PCR，扩增出13种轻链基因和28种重链 Fd基因。将轻、重链基因与载体连接后，导入大肠杆菌XLI—BLue。 x107的噬菌体抗体库，噬菌 经氨苄青霉素抗性筛选，得到库容为1．7 体DNA中轻重链基因的插入率约为i00％。用人肝癌细胞系HepG2 和人肝细胞系张氏肝细胞对抗体库进行三轮正负淘选和富集后，从 中随机挑取540个克隆进行ELISA筛选，得到163个阳性克隆，阳 性率为30．2％。将163个阳性克隆进一步进行其他细胞系的鉴定， 性反应，而与正常肝细胞系张氏肝细胞、骨髓间质干细胞HBMSC、原 代培养的脐静脉内皮细胞HUVEC及其他人肿瘤细胞系反应呈弱阳性 或不反应。细胞免疫组化结果与细胞ELISA结果基本一致；免疫组 织化学结果显示与人肝癌组织有特异性反应，而与正常肝组织几乎 不反应，反应部位主要见于胞膜、胞浆。对克隆E35进行测序分析， 结果表明：重链基因可变区与人胚系IgVH3—21有97．1％的同源性， 轻链可变区基因与人胚系IgVl-13有91．3％的同源性。 结论：应用体外抗原致敏方法和EBV转化技术联合噬菌体抗体 107的全人源抗肝癌Fab抗体库。通过 库技术，构建库容量达1．7X 细胞ELISA和免疫组化鉴定，获得的噬菌体抗体克隆E35具有较强 的特异性，为肝癌的临床诊断及导向治疗奠定了基础。 关键词EB病毒转化，噬菌体抗体库，肝癌，Fab抗体 Ⅱ ABSTRACT toconstructthe ofthis was Objecfive：Thepurpose study fully humanized Fab then fragmentlibrary．AndbY anti-hepatoma phage the triedto outseveralcoloniesthat library,wepick express screening the ofthe cells antibodies againstantigenshepatomaspecifically． blood mononuclear METHoDS：Peripheral isolatedfromlivercancer wereimmunized加vitrowith patients carcinomacell thattreated Candthen hepatoma HpeG2 bymitomycin weretransformed carcinoma