丝瓜籽核糖体失活蛋白基因Luffin—a原核表达载体的构建.docVIP

丝瓜籽核糖体失活蛋白基因Luffin—a原核表达载体的构建 　　[摘要] 目的 探讨丝瓜籽核糖体失活蛋白基因Luffin-a原核表达载体的构建方法。 方法 从Pubmed中查到Luffin-a的mRNA全序列，用RT-PCR的方法从未成熟的丝瓜种子中克隆Luffin-a基因，T-A克隆后鉴定核苷酸序列，构建原核表达载体pET-15b（+）-Luffin-a，转化大肠杆菌BL21（DE3），并经IPTG诱导表达；SDS鉴定Luffin-a表达产物。结果 克隆出Luffin-a基因，IPTG诱导后大肠杆菌培养液和超声破碎的菌体沉淀中都有Luffin-a表达产物。 结论 本研究成功构建了Luffin-a原核表达载体。 　　[关键词] 丝瓜籽；核糖体失活蛋白；Luffin-a基因 　　[中图分类号] R3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）03（a）-0022-03 　　核糖体失活蛋白（RIP）是一种能够使真核细胞核糖体28s rRNA第4 324位腺嘌呤糖苷键水解、断裂，从而使真核细胞蛋白质合成受到不可逆抑制的蛋白，广泛存在于丝瓜种子中。目前分离到的Luffin-a[1-3]、Luffin-b[4]以及新型小分子蛋白Luffin-s[5]、Luffin-P1[6，7]均属于Ⅰ型RIP。进年来的研究发现，RIPs能抑制HIV病毒在急慢性感染的淋巴细胞和单核巨噬细胞中的复制，具有抗病毒、抗肿瘤、诱导细胞凋亡等生物活性[5，8]。本实验成功构建Luffin-a的原核表达载体，对Luffin-a的体外表达做了初步研究。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　大肠杆菌TOP10 感受态细胞和BL21（DE3）pLys表达菌株及克隆载体pGM-T均购自TIANGEN公司，原核表达载体pET-15b（+）由湖北医药学院附属人民医院临床医学研究所赠送。Trizol购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自Promega公司，2×Taq PCR MasterMix、质粒小提试剂盒、pGM-T克隆试剂盒、DNA纯化回收试剂盒、DNA Marker D2000、D15000、DNA Marker Ⅳ、IPTG均购自TIANGEN公司，限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ购自Fermentas公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 提取总RNA及cDNA第一链合成 用Trizol常规提取未成熟丝瓜种子总RNA，用50 μL DEPC H2O溶解RNA样品，紫外分光光度仪检测RNA样品浓度与纯度，-80℃保存备用。以2 μg总RNA为模板，按逆转录试剂盒说明操作，反应体系：oligdT 2 μL，10 mmol/L dNTP 1.25 μL，加入RNA适量体积后用DEPC H2O补足体积至18.5 μL，70℃反应5 min，立即插冰上；再加入逆转录酶mmlv（200 U/μL）1 μL，抑制剂rRNasin（40 U/μL）0.5 μL，5×buffer 5 μL，使总反应体系为25 μL，42℃反应1 h，95℃反应3 min终止反应，cDNA产物-20℃保存。 　　1.2.2 引物设计及Luffin-a基因PCR扩增 根据Pubmed中检索得到的Luffin-a核酸序列，由上海生工设计合成一对引物，在正向引物5端引入NdeⅠ酶切位点，在互补链引物5端引入BamHⅠ酶切位点（斜体），上下游引物之间扩增产物长760 bp。上游引物：5-gcccatatggatgtgaggttcagtttgtc-3；下游引物：5-ggcggatcctcacgcaacatt ttgtttgta-3。PCR反应体系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 6.5 μL，94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环，最后72℃延伸10 min；PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。 　　1.2.3 PCR产物纯化及Luffin-a表达载体的构建 根据DNA纯化回收试剂盒说明操作将PCR产物进行纯化，按照pGM-T克隆试剂盒说明将Luffin-a基因PCR产物与pGM-T载体连接，连接产物转化感受态细胞TOP10，通过蓝白斑筛选，挑取白色单克隆菌扩增，用质粒小提试剂盒提取重组质粒，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，重组质粒命名为pGM-T-Luffin-a，采用菌落PCR和双酶切鉴定，再用1%琼脂糖凝胶电泳检测。将重组质粒pGM-T-Luffin-a和原核表达载体pET-15b（+）分别进行NdeⅠ、BamHⅠ双酶切，20 μL反应体系（Nd