谈复方汉防己对肝星状细胞的增殖和TTR，ITIH1，SERPINF2 表达的影响.docVIP

谈复方汉防己对肝星状细胞的增殖和TTR，ITIH1，SERPINF2 表达的影响 　　肝硬化是严重和不可逆的慢性肝脏疾病，而近年来研究发现作为由正常肝脏发展至肝硬化必经过程的肝纤维化却是可逆性病变。临床研究结果提示复方汉防己有较好的抗肝纤维化的作用，细胞培养结果证实，复方汉防己能抑制人胚肺成纤维细胞合成细胞外基质的能力，但其对肝纤维化的关键细胞--肝星状细胞( hepatic stellate cell，HSC) 的生物活性的影响尚无报道。本文通过研究复方汉防己对HSC 增殖、相关基因及蛋白表达的影响，观察复方汉防己抗肝纤维化的作用。 　　1 材料 　　1. 1 复方汉防己的制备 　　自制复方汉防己水提醇沉提取液( 汉防己5 g，丹参2. 5 g，半枝莲2. 5 g，虎杖3. 75 g，黄芪5 g 等制成水提醇沉提取液，使每毫升含生药2. 5 mg) ，经0. 45 mu;m 滤膜过滤除菌，4℃保存备用，临用前用含10% 胎牛血清的培养液释成不同浓度。 　　1. 2 细胞系肝星状 　　细胞株HSC-T6 由UCSF 肝脏中心实验室Friedman 教授惠赠，其表型为活化的HSC。选择对数期生长的大鼠HSC-T6 细胞株，胰酶消化后，用含10%胎牛血清的培养液调整细胞浓度为1. 2 times; 108 个/L，分别加入培养板中，复方汉防己组分4 个浓度，每个浓度作3 个复孔，置37 ℃，5%CO2和95%O2的细胞培养箱中孵育24 h 后，分别加入复方汉防己提取液( MTT 法检测复方汉防己提取液抑制HSC-T6 的半数抑制浓度为25. 49 g ·L - 1，经过预实验，确定药物浓度) ，使每组药物浓度( 生药) 分别为2. 5， 0. 25， 0. 025， 0. 002 5 g·L - 1，干扰素gamma; 组药物浓度为1 times; 106 U·mg - 1，另设空白对照组，再培养48 h，收取细胞并提取上清进行检测。 　　1. 3 试剂 　　胎牛血清为Gibco 公司产品; DMEM 为Hyclone 公司产品; Total RNA 提取试剂、逆转录试剂盒、荧光染料均为宝生物工程( 大连) 公司产品;ITIH1，SERPINF2，TTR 一抗为SANTA CRUZ 公司产品; 二抗为北京中杉金桥公司产品; DAPI 为碧云天公司产品; ELISA 试剂盒为Ramp;D 分装。 　　1. 4 仪器HF240 CO2 　　培养箱( 上海力申) ，TE300倒置显微镜( 日本尼康) ，LC480 PCR 扩增仪( 瑞士Roche 公司) ，FC500MPL 流式细胞仪( 贝克曼库尔特) ，VARIOSKAN FLASH 全波长多功能酶标仪( 美国Thermo scientific) ，LSM710 激光共聚焦显微镜( 德国ZEISS) 。 　　2 方法 　　2. 1 流式细胞仪检测复方汉防己和干扰素gamma; 对HSC-T6 增殖的影响胰酶消化，收取各孔细胞，加预冷PBS 缓冲液，低速离心去除细胞碎片，加入PI染色液A 1 mL，4 ℃避光染色30 min，然后加入PI染色液B 1 mL，4 ℃避光染色30 min，上机检测。 　　2. 2 复方汉防己和干扰素gamma; 对TTR， ITIH1，SERPINF2mRNA 水平的影响RNA 的提取: 用宝生物公司生产的RNAiso Plus 提取HSC-T6 总RNA，用酶标仪检测提取的RNA 浓度，A260 /A280在1. 8 ～2. 2。cDNA 的合成: 用宝生物公司生产的RealtimeRT-PCR 20 mu;L 反应体系试剂盒，依次加入5 times;PrimeScript Buffer 4 mu;L，PrimeScript RT Enzyme Mix I1 mu;L，Oligo dT Primer 1 mu;L，Random 6 mers 1 mu;L，待测RNA 1 mu;g，RNase Free dH2O 补充到20 mu;L，进行反转录反应，37 ℃ 15 min，反转录酶的失活反应， 85℃ 5 s。PCR 扩增: 反应体系为20 mu;L，内含SYBRPremix Ex Tag 10 mu;L，TTR，ITIH1，SERPINF2 及beta;-actin引物各2 mu;L，DNA 模板2 mu;L，dH2 O 6 mu;L，PCR 反应参数为: 95 ℃预变性30 s， 95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸20 s，40 个循环。引物为博尚生物公司设计合成， ITIH1 上游引物5#39;-TGAGCCGCAGGGGATCAGCA-3#39;， 下游引物5#39;-GGCTCACAGTGG