SS熊胆眼药水刺激性探究.doc

SS熊胆眼药水刺激性探究摘 要:目的:构建滴眼液刺激性体外评价方法,筛查SS熊胆眼药水刺激性原因并采取适宜方法解决。方法:采用兔角膜上皮细胞毒性试验(SIRC-MTT)对4种熊胆滴眼液进行评价,将结果与临床刺激性评分进行相关性分析,运用SIRC-MTT筛查SS熊胆眼药水的刺激性原因并进行解决。结果:相关系数为0.961,说明SIRC-MTT能较好评价熊胆滴眼液眼刺激性;造成熊胆眼药水刺激性较强的原因为羟苯乙酯与熊胆原液的共存;采用减少羟苯乙酯用量(调整至0.04%)、添加羧甲基纤维素钠(0.2%~0.25%)均能增加角膜上皮细胞存活率。结论:SIRC-MTT是SS有效的体外刺激性评价方法;降低羟苯乙酯用量和添加羧甲基纤维素钠均能降低熊胆眼药水的刺激性。 关键词:刺激性;熊胆眼药水;细胞毒性试验;角膜上皮细胞 中图分类号:R988.1文献标识码:A文章编号:1673-2197(2009)06-0022-04 SS熊胆眼药水由熊胆单味中药研制而成,具有清热解毒,祛翳明目的功效,主要用于治疗急、慢性卡他性结膜炎,但大多患者在使用中发现该药具有较强刺激性,严重影响了其临床用药。现今评价眼刺激性的方法为兔眼刺激法(draize test),该法具有主观性强,实验差异大等缺点[1],难以寻找出SS熊胆眼药水刺激性较强的内在原因。该研究拟建立SS新的体外刺激性评价方法,用于筛查该眼药水的刺激性原因,并解决该问题。 1 材料与方法 1.1 受试物、仪器与试剂 SS熊胆眼药水(成都某药业公司提供),熊胆粉滴眼液(某药业公司),熊胆黄芩滴眼液(黑龙江黑宝药业),复方熊胆滴眼液(长春普华药业),熊胆、羟苯乙酯、羧甲基纤维素钠(成都某药业公司提供),氯化钠、硼酸、硼砂(科龙试剂有限公司),透明质酸钠(Solarbio);二氧化碳培养箱(Thermo),超净工作台(苏州净化),倒置显微镜(奥林巴斯),自动酶标仪(BIO-RAD),DMEM低糖(GIBCO,USA),胎牛血清(甘肃民海),MTT(SIGMA,USA),F12(GIBCO,USA),青霉素(石家庄制药有限公司),链霉素(华北制药股份有限公司),L-谷氨酰胺 DMSO(SIGMA,USA)。培养基组成(20%胎牛血清, F12培养基∶DMEM低糖=3∶1,2mM/100mL谷氨酰胺,100U/mL双抗溶液)。 1.2 动物 健康白种家兔,雌雄不限,体重2500±200g,成都中医药大学动物实验中心提供。 1.3 兔角膜上皮细胞的培养[2,3] 健康白种家兔,断头放血处死后,无菌条件下摘取眼球,104U#8226;L-1青链霉素溶液漂洗2次,,取角膜缘部上皮组织:沿角巩膜缘灰白交界后1mm处穿刺,取下包括1mm巩膜缘的眼前段组织,解剖镜下去除晶状体、虹膜等附属组织,将得到的角膜组织逐个撕取角膜内皮及后弹力层,然后沿透明角膜内1mm,环状取下2～2.5mm宽的角膜缘组织,剪成1mm×1mm×1mm大小;将组织块平铺于培养瓶中,置37℃、5%CO2恒温培养箱中培养,3d首次换液,以后隔日换液。原代培养至80%融合后,0.25%胰酶消化传代, 3d后首次换液,以后隔日换液,直至细胞融合。传代细胞(2-4代)用于实验研究。将实验用细胞以104个/孔细胞接种于96培养板中,培养(37℃、5%CO2)5d,细胞达到铺平状态。 1.4 评价方法的建立 1.4.1 市售滴眼液刺激性评价 对市售4种熊胆滴眼液临床用药状况进行分析,其刺激性评价结果见表1。 1.4.2 体外刺激性评价方法 (1)直接接触法[4]。 将培养液吸出,加入不同滴眼液溶液100μL作用20min,吸出滴眼液,PBS冲洗两次,加入含10%胎牛血清培养基180μL,20μLMTT(5mg/mL),37℃孵育4h,吸出培养基,加入150μLDMSO,570nm酶标仪测定吸光度。 (2)混合培养法[5]。将培养液吸出,加入含40μL的滴眼液样品的培养基继续培养24h,然后吸出含样品溶液的培养基,其它同直接接触法。 对照组采用PBS溶液,细胞存活率作为评价指标。细胞存活率(cell survival rates)=活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%=(实验组吸光度值-空白对照组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白对照组吸光度值)×100%。各浓度样品设6个复孔进行试验。 将由直接接触法与混合培养法评价滴眼液对兔角膜上皮细胞毒性的实验结果与临床刺激性评分进行相关性研究,选择相关性较好的方法作为本研究评价细胞毒性的方法。 1.5 刺激源筛查 熊胆眼药水刺激性源可能来自处方中不同物质之间的相互作用,也可能来自制备工艺各环节。本研究