慢传输型便秘大鼠结肠壁内神经形态学及Cajal间质细胞改变.doc

慢传输型便秘大鼠结肠壁内神经形态学及Cajal间质细胞改变[摘要]目的：研究慢传输型便秘大鼠结肠壁内神经形态学和Cajal间质细胞的改变，探索结肠动力减弱的原因，为临床治疗提供理论依据。方法：采用免疫组织化学方法研究30例结肠慢传输型便秘大鼠（STC组）和15例非便秘性大鼠（正常对照组）的结肠肌间神经丛内S-100蛋白和CAD的表达，以及Cajal 间质细胞的改变。结果：STC组结肠肌间神经丛S－100、CAD主要表现为：黄褐色颗粒染色变深、浓集而且均匀性降低。CD117表达数量减少，染色强度变弱，大部分出现阴性表达。结论：STC组便秘3个月的大鼠，ICC网络减少或缺失，神经节细胞功能代偿性增强而且紊乱，导致神经纤维挛缩或者欠协调。 [关键词]慢传输型便秘；结肠神经丛；免疫组织化学 [中图分类号]R361 [文献标识码]B[文章编号]1673-7210（2007）07（ｃ）-122-02 慢传输型便秘(slow transit constipation, STC) 是一类以胃肠动力减弱为主要特点的顽固性便秘。由于临床上难以对便秘患者进行前瞻性研究，因而对其病因及发病机制缺乏深入的认识。目前国内外STC 的病理学研究对象主要为手术切除的人体标本，缺乏前瞻性的研究资料，而临床便秘患者就诊前大多有长期服药史，关于结肠的病理改变是否为继发性争议较多。本研究应用中药大黄建立大鼠STC模型，对结肠神经系统和Cajal间质细胞改变进行观察，初步探讨STC的发病机制。 1 材料和方法 1.1 STC大鼠模型的建立 选取体重100～120 g的健康Wistar大鼠40只，按随机化原则分为正常对照组（空白）15只，STC组30只，分别喂饲普通饲料及含大黄的饲料，给药剂量为600 mg/kg体重。饲养90 d后，通过活性炭灌胃法测定肠道传输功能，确定成功建立大鼠模型。 1.2 结肠取材和标本处理 大鼠禁食12 h，3%戊巴比妥钠麻醉后，取整段结肠放入4%多聚甲醛中，固定6～8 h，然后把全部结肠段同心圆状缠绕在直径0.5 cm的圆柱上，用大头针从一侧穿入另一侧穿出以维持肠段的同心圆形状，小心从圆柱上取下肠组织并固定于4%多聚甲醛中24 h，以待脱水包埋。 1.3 检测原理 S-100是神经胶质细胞的特异性蛋白，亦可存在于神经纤维中，可作为肠道神经丛中胶质细胞和神经纤维的标记。组织蛋白酶D(cathepsin D，CAD)是一种天冬氨酸蛋白酶，可作为肠壁神经节细胞的标记。酪氨酸激酶受体c-kit（CD117）是ICC 细胞的特异性标志物。 1.4 HE常规和免疫组化染色 把同心圆状结肠组织平放于脱水盒中，梯度酒精脱水，石蜡包埋。用连续组织切片法切取厚4 μm的组织块，40℃10 h烘干，制作切片，做HE常规和CD117、NSE、S-100、CAD和CD68等免疫组化染色。 1.5 肠壁形态学和免疫组化观察 包括肠壁和结肠壁肌间神经丛的常规形态学和免疫组化染色情况，重点观察神经节细胞数量、排列分布形态、变性情况。免疫组化结果判断，棕黄色为阳性信号，CAD、S-100的阳性表达部位均位于细胞质。观察指标以“-、+、++、+++”表达染色的深浅。（-）为阴性染色，（+）为弱阳性染色，（++）为阳性染色，（+++）为强阳性染色。 2 结果 2.1 HE染色 结肠黏膜、黏膜下层、肌层和浆膜层在对照组和模型组之间未见显著性改变，只在模型组个别大鼠黏膜层见到轻度炎症和较多的淋巴虑泡形成。仔细寻找并观察肌间神经丛和黏膜下神经丛，发现黏膜下神经丛数量很少，不容易找到，肌间神经丛数量多，且分布有一定规律，镜下每个视野都能够找到。 对照组结肠肌间神经丛神经节内神经细胞、神经胶质细胞及其突起组成神经毡，平面观察神经元与胶质细胞之比约2～3∶1。神经节外仅包被一层薄的基板。肌间神经节呈椭圆型，每个神经节内所有细胞数量从数个到数十个不等，所有细胞排列疏密较均匀。神经节之间均匀排列，大灶和小灶呈一定规律排列。神经元细胞较大，直径15～30 μm，呈圆形或者椭圆形，胞浆淡染或者嗜酸，核大，偏位，有不清晰的核仁。神经毡内可见神经轴突及树突的横切面与纵切面。 模型组与对照组相比肌间神经丛大部分神经节无明显变化，只有部分神经节排列间隔出现不一致，节内细胞排列紧密或者固缩，个别神经节变小或者消失。 2.2 免疫组化染色 对照组和模型组CD68染色均为阴性；NSE大部分为阴性，个别神经节呈弱阳性或者（±）。 2.2.1 对照组S-100：S-100对神经丛中神经纤维和神经胶质细胞表达均为阳性染色，呈黄褐色，阳性强度为（++）～（+++）。在低倍镜下可见纤维束细长