抗BCG Hsp65单克隆抗体的鉴定及应用研究.doc

　　抗BCG Hsp65单克隆抗体的鉴定及应用研究 ：尹晓光, 吴秀丽, 万敏, 张培因, 王艳媚, 王丽颖, 于永利 【摘要】 　　目的: 对制备的5株抗BCG Hsp65单克隆抗体（Hsp65 mAb）做进一步鉴定和应用。方法: 采用ELISA方法对mAb的效价、 亚类和结合抗原表位特性进行鉴定, 应用mAb对Hsp65融合蛋白进行了UC1检测结果, 与MUC1 mAb的一致。细胞免疫荧光检测显示, 制备的 mAb能够识别通过蛋白装载进入树突状细胞内的Hsp65-PSA。结论: 获得的Hsp65 mAb可做为检测工具, 用于研究BCG Hsp65及其融合蛋白的功能和表达。 【关键词】 BCG 热休克蛋白 单克隆抗体 　　来自分枝杆菌BCG的Mr 65000热休克蛋白（Hsp65）具有交叉提呈外源性抗原肽的功能, 已经引起免疫学家的高度重视［1］, 一些用于 治疗 肿瘤和病毒性疾病的Hsp65融合蛋白类疫苗已被研制［2, 3］。为研究此类疫苗的作用机制和纯化工艺, 我们先前利用Hsp65融合蛋白制备了5株Hsp65单克隆抗体（mAb）［4］, 本实验中我们对上述mAb做进一步鉴定, 并初步应用制备的mAb对Hsp65融合蛋白进行了研究。 　　 1 材料和方法 　　1.1 材料 Hsp65、 Hsp65-MUC1、 Hsp65-PSA和Hsp65-GFP蛋白及分泌Hsp65 mAb的5株杂交瘤细胞由吉林大学基础医学院分子生物学教研室制备; HRP-羊抗鼠IgG、 HRP-羊抗鼠IgG1和HRP-羊抗鼠IgG2a及重组人的白介素4（rhIL-4）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）购自BD公司; CY3-羊抗鼠IgG和MUC1 mAb购自Sigma公司; 淋巴细胞分离液为TBD公司产品; 胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司; 来自健康人外周血的浓缩白细胞由长春中心血站提供。 　　1.2 方法 　　1.2.1 mAb效价和亚类检测 将杂交瘤细胞进行培养并制备腹水, 用完全培养液（medium）对各株杂交瘤细胞的培养上清或腹水做10倍倍比稀释。在抗体效价检测时, 以包被酶标条的Hsp65蛋白为检测抗原, 系列稀释的培养上清和腹水为检测样品, medium为阴性对照, HRP-羊抗小鼠IgG为示踪抗体, 用常规ELISA方法检测［4］。在抗体亚类检测时, 以杂交瘤细胞培养上清做为检测样品, HRP-羊抗小鼠IgG1或HRP-羊抗小鼠IgG2a为示踪抗体, 其他同抗体效价检测过程。 　　1.2.2 mAb识别抗原表位分析 检测过程参照传统ELISA方法［5］, 并进行了改动。根据上述的mAb亚类检测结果, 在IgG1和IgG2a亚类mAb之间进行抗体配对。将配对的mAb先后与相同的Hsp65抗原反应, 通过检测后一种亚类mAb结合到固相抗原上的量, 判断配对mAb间是否存在抗原表位竞争结合作用。具体过程如下: 在包被Hsp65重组蛋白的酶标条中, 先加入0.1 mL IgG2a亚类mAb（做为抑制抗体）或0.1 mL medium（做为阴性对照）, 每种样品设3复孔。经过温浴反应和适当冲洗, 每孔均加入0.1 mL IgG1亚类mAb（做为结合抗体）。经过温浴和冲洗, 加入0.1 mL HRP-羊抗小鼠IgG1（做为示踪抗体）。酶标条用DAB底物显色后, 在492nm波长下检测样品的光密度值（A492）, 结果用SPSS软件统计分析。依据各mAb组与medium阴性对照组之间的A492值是否存在明显差异, 判断IgG2a亚类mAb与配对的IgG1亚类mAb之间, 结合到Hsp65抗原上位点的空间位置关系。 　　1.2.3 UC1菌体裂解蛋白和纯化蛋白, 经SDS电泳分离后, 进行蛋白染色和转膜。应用Hsp65 mAb和MUC1 mAb, 对各自的蛋白转移膜进行UC1的化学发光结果与考马斯亮蓝染色结果进行比较。 　　1.2.4 树突状细胞（DC）的分离、 培养和装载蛋白 来自健康献血者的浓缩白细胞, 通过淋巴细胞分离液、 密度梯度离心和聚苯乙烯培养板黏附过程, 分离出人外周血中的单核细胞［6］。将细胞按1×109/L的浓度接种12孔培养板（完全培养液为含100 mL/L牛血清的IMDM, 条件培养液为含5×105 IU/L rhIL-4和rhGM-CSF的完全培养液）, 用条件培养液诱导培养的单核细胞转化成DC。当培养到第5天时, 用完全培养液稀释DC至1×1010/L浓度, 取20 μL DC悬液, 滴加在1×1 cm的玻璃盖玻片上, 并在培养箱内培养1 h, 用于制备DC爬片。 经过适当冲洗后, 获得的DC爬片被分成2组, 各自装载Hsp65-PSA和Hsp65-GFP蛋白。装载的蛋白浓度为1 g/L, 装