shRNA介导GSTP1基因沉默对激素非依赖性前列腺癌细胞株DU145的影响.pdfVIP

， 2呲 (8) 一 csumea-ors；http：／／xbyx一 ．net 807 shRNA介导GSTP1基因沉默对激素非依赖性 前列腺癌细胞株 DU145的影响 金鹏 ，谢晋 良，朱向荣 ，周成 ，丁翔 ，杨罗艳。 (中南大学 1．湘雅医院器官移植中心，长沙410008；2．湘雅二医院泌尿外科，长沙410011) [摘要】目的：探讨谷胱甘肽巯基转移酶P1(glutathioneS-transferaseP1，GSTP1)基因沉默对雄激素非依赖性前列 腺癌细胞株DU145增殖活性和对化学治疗药物敏感性的影响。方法：根据选取靶序列形成短发卡状 RNA(shorthairpin RNA，shRNA)的DNA模板设计 3条表达载体 (shRNA255，shRNA554，shRNA593)，并克隆到质粒 pGPU6／GFP／Ne0。经 酶切和测序鉴定，筛选转染率最高基因沉默效果最好的shRNA作RNA干扰。DU145细胞株分为空白质粒转染组和 shRNA转染组。转染前后按化学治疗药物分为氟尿嘧啶 (fluorouracil，FU)组及紫杉醇 (paclitaxel，PA)组，并按作 用浓度 (FU：30，60，120，240~tg／mL；PA：0．2，2，10，20t~g／mL)分别分成4个亚组，并分别设有一个空白对照 组。四甲基偶氮唑盐 3【一(4，5-dimethylthiazol一2一y1)一2，5-diphenyltetrazoliumbromide，MTr|l比色法检测转染后细胞增殖活 性的变化，MTT及末端脱氧核苷酸转移酶介导脱氧尿苷三磷酸缺 口末端标记法 (terminalde—oxynucleotidyltransferase— mediateddUTPnickendlabeling，TUNEL)检测转染前后不同浓度 Fu和PA对 DU145细胞抑制增殖及诱导凋亡的效果。 结果：3条表达载体 (pGPU6／GFP／Neo-shRNA255，pGPU6／GFP／Neo—shRNA554，pGPU6／GFP／Neo—shRNA593)的转染率分 别为 (63_3±1．04)％，(76．2±0．68)％，(72．7±0．33)％，shRNA554转染率最高，三者之间比较差异有统计学意义 (P0．01)。 转染后mRNA含量分别为128．31±2．50，43．24±4．30和85．62±6．30，GSTP1蛋白含量分别为163．92±12．40，65．38±9．30 和 114．25±16．70，shRNA554转染后GSTP1基因mRNA和蛋 白含量均最低，三者 比较差异有统计学意义 fP0．01)。 MTI检测转染前Fu不同浓度 (30，60，120，240tc／mL)四个亚组作用后细胞存活率分别为 (95．60±2．11)％，(90．20±0．86)％， (83．10±3．12)％和 (74．60±1．32)％；转染后存活率为 (91．30±1．43)％，(84．6±2．13)％，(73．2±1．52)％和 (65．5±0．94)％。 TUNEL检测转染前Fu不同浓度 (30，60，120，240 mL)四个亚组作用后细胞凋亡率分别为 (5．50±0．88)％，(10．20± 1．64)％，(15．20±2．39)％和 (25．10±2．59)％；转染后凋亡率 (10．80±0．62)％，(15．70±1．32)％，(20．40±1．89)％和 (34．90±2．54)％。转染后相同Fu浓度下细胞存活率降低，凋亡率增加，差异均具有统计学意义fp0．O1)。MTY检测转 染前PA不同浓度 (0．2，2，10，20p．gm／L)四个亚组作用后细胞存活率为 (98．50±2．34)％，(95．20±1．32)％，(89．40±0．68)％ 和 (82．70±1．73)％；转染后存活率为 (94．2±0．78)％，(86．5±2．13)％，(78．7±1．34)％和 (70．1±0．76)％。TUNEL检测转 染前PA不同浓度 (0．2，2，10，20p．g／mL)四个亚组作用后细胞凋亡率分别为 (2．4±1．07)％，(5．2±1．33)％，(10．5±2-41)％ 和 (20．7±1．92)％；转染后凋亡率 (5．46±2．13)％，(13．8±1．24)％，(21．2±2．39)％和 (29．2±2．21)％。转染后