重组慢病毒载体的构建及其感染人脐带间充质干细胞的研究.pdfVIP

· 14 · 中国小儿血液与肿瘤杂志 2014年2月第 l9卷第 1期 JChinaPediatrBloodCancer，February2014，Vol19，No．1 DOI：10．3969／j．issn．1673—5323．2014．01．005 ·论 著 · 重组慢病毒载体的构建及其感染 人脐带间充质干细胞的研究 刘思征 赖秀蓝 陈元 国 贺谷雨 MartinMaldonado 林丽敏 谢丽春 吴卫照 黄天华 蔡志伟 刘必刚 马廉 【摘要】目的 利用包装制备的重组慢病毒载体感染人脐带间充质干细胞，为后续的细胞重编 程奠定基础。方法 利用组织块贴壁法分离、培养、扩增出人脐带间充质干细胞(HUMSC)。携带 目的基 因(oct4、sox2、klf4、c—myc)及绿色荧光蛋白的质粒经验证、扩增后 ，转染HEK一293T细胞．制 备携带上述基因的慢病毒上清液。荧光显微镜下梯度稀释法检测病毒滴度。慢病毒液感染3 5 代生长 良好的HUMSC，荧光显微镜及流式细胞术检测病毒感染力，RT．PCR及定量 PCR检测 目的 基因mRNA水平。结果 成功验证、扩增携带 目的基因的质粒。制备的新鲜病毒液滴度达5X10。 U／mL，冻存后降为5X10。U／ml。重组慢病毒感染HUMSC的感染力高于80％，4种 目的基 因的表 达均明显高于对照。结论 重组慢病毒载体可以在体外高效的转染HUMSC，并稳定表达 目的基 因，是 HUMSC重编程的有效基因转移载体。 【关键词】 重组慢病毒载体； 基因转染； 人脐带间充质干细胞； 绿色荧光蛋白； 浓度 梯度稀释法； 细胞重编程 Construction of recombinant lentiviralvector and its infection of human umbilical cord mesenchymal stem cells LIU Sizheng ， ， Xiulan ， CHEN Yuanguo ， HE Guyu ．- ， Mart(nMaldonado’’，LINLimin，XIELichun ， Weizhao ，HUANGTianhua。CAIZhiwei．一，HUBigang．一． ， MA Lian ． Pediatric department：2．Transformation MedicalCenter．Second Affiliated Hospitalof ShantouUniversityMedicalCollege，ShanTou515041，China Correspondingauthor：MA Lian。Email：malian8965@ sina．corn 【Abstract】Objective Toconstructrecombinantlentiviralvectorswiththeaimofinfectinghuman umbilicalcordmesenchymalstemcells(HUMSC)forsubsequentcellreprogramming．Methods A tissueadherentmethodwasperformed toisolate，cultureand expandHUMSC．Fourdifferentplasmids containingonefactor：Oct4，Sox2，Klf4andc—Myc(OSKM)withGreenFluorescentProtein (GFP)， wereanalyzedby gene sequencingand then amplifiedby competentE．Coli．Recombi