HPLC法检查甲睾酮片的有关物质.docVIP

精品论文 参考文献 HPLC法检查甲睾酮片的有关物质 吴孟岚 杨进 　　（黔东南州食品药品检验检测中心；贵州凯里 556000） 　　摘要：目的 探讨甲睾酮片有关物质检查方法。方法 采用采用高效液相色谱(HPLC) 法, 色谱柱为C18柱(150 mm times;4.6 mm, 5mu;m);以甲醇-水(68：32)为流动相;检测波长288 nm;柱温30℃;流速1.0 ml?min-1。结果 在选定的色谱条件下, 主成分与有关物质能完全分离, 各杂质峰分离良好。结论 该方法专属性强、灵敏度高、重复性好, 可用于检查甲睾酮片的有关物质。 　　关键词：甲睾酮片 有关物质 高效液相色谱法 　　甲睾酮为人工合成的甾类激素, 具有促进男性性器官及副性征的发育成熟、对抗雌激素和促进蛋白质合成与骨质形成等作用，化学名称为 17alpha;-甲基-17beta;-羟基雄甾-4-烯-3-酮。甲睾酮片近几年来临床无不良反应的报道，但通过检索文献发现服用甲睾酮片有过敏反应的情况，而且17-alpha;-烷基类的激素一般都有肝损伤。为有效控制产品质量，对其有可能存在的杂质进行研究，考察甲睾酮片的有关物质。 　　1 实验部分 　　1.1 仪器与试药 　　高效液相色谱仪（日本岛津SIL-20A），甲睾酮对照品（100172-200503，中国药品生物制品检定所），甲睾酮片，甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。 　　1.2 方法与结果 　　1.2.1 色谱条件与系统适应性试验 　　十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（68：32）为流动相；检测波长为288nm；理论塔板数按甲睾酮计不低于1500，甲睾酮峰与相邻峰的分离度均符合要求。 　　1.2.2 溶液的制备 　　取甲睾酮片10片，研细，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含0.6mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取供试品溶液2ml，置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为对照溶液。取不含甲睾酮的空白对照适量, 按供试品制备方法制成阴性对照溶液。 　　1.2.3 专属性 　　在“1.2.1”项的色谱条件下，精密量取甲睾酮对照品溶液、空白对照溶液、供试品溶液各10mu;l, 分别进样, 记录色谱图。由图1可知, 原料药杂质峰、辅料峰、主成分峰均能完全分离, 辅料无干扰。 　　 　　图1 阴性对照溶液（A）、甲睾酮对照品溶液（B）、供试品溶液（C） 　　精密量取2 ml供试品溶液4份, 分别进行如下操作:加5 ml甲酸溶液, 在100℃水浴中加热50 min;加5 ml氨水, 在60℃水浴中加热30 min;加5 ml30%过氧化氢溶液, 在100℃水浴中加热50 min;在100℃烘箱中加热8 h。将以上各破坏样品稀释制成0.6 mg?ml-1的降解溶液。照“1.2.1”项下的色谱条件, 精密量取10 mu;l上述降解溶液, 分别进样, 记录色谱图。由图2可知, 各破坏试验产生的降解产物峰均能与主成份峰完全分离。 　　 　　图2 供试品未破坏（A）、酸破坏（B）、碱破坏(C)、氧化破坏（D）、高温破坏（E） 　　1.2.4　检测限与耐用性试验 　　取供试品溶液, 用甲醇稀释成系列浓度, 进样, 当S/N=3时, 测得检测限为0.06 ng[2]。在“1.2.1”项色谱条件的基础上, 对流动相的组成、流速、柱温、同类型不同品牌的色谱柱进行耐用性试验。结果表明, 当系统条件发生微小变动时, 测定结果不受影响。说明本法的耐用性良好, 符合测定要求。 　　1.2.5　有关物质的测定 　　照“ 1.2.1”项下的色谱条件, 取10 mu;l对照品溶液进样, 调节检测灵敏度,使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%, 精密量取供试品溶液与对照溶液各10 mu;l, 分别进样, 记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积（2.0%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍（3.0%）。供试品溶液色谱图中任何小于对照溶液主峰面积的0.025倍的峰可忽略不计。 　　对34批样品的有关物质进行了检查，结果见表1。 　　表1 甲睾酮片有关物质检验结果 　　 　　2 讨论 　　2.1 试验中用LC-MS-MS分析了甲睾酮片中的杂质，通过LC-MS-MS对甲睾酮片及原、辅料的研究发现其有m/z301.4的杂峰，用DAD对原、辅料进行分析，辅料在241nm波长下对杂质测定存在干扰，m/z301.4的杂峰在288nm处有最大吸收且辅料干扰较弱。故HPLC的检测波长确定为288nm。 　　2.2 《中国药典》2015年版二部甲睾酮原料药有关物质的方法中流动相为甲醇-水（72:28）[1]，该流动相比例m/z301.4的杂峰无