冬虫夏草分离株的分子鉴定及主要活性成分测定.pdfVIP

食 用菌 EDIBLE FUNGI 2009(5) 冬虫夏草分离株的分子鉴定及主要活性成分测定 尹小武 李卓涵 刘书畅 董德贤 李荣秀 (上海交通大学生命科学与技术学院，上海闵行 200240) 摘 要 对冬虫夏草分离株进行 DNA鉴定，测定其固体培养 培养菌丝体 (改 良PDA培养)，液氮冷冻研磨至粉末状 ，加入 菌丝体 中虫草多糖、腺苷和虫草素 。方法 采用 PCR技术，以 300 L溶菌酶裂解液 (10mmol／LZnC12，lOmg／mL溶菌酶)， rDNA—ITS区为分子指标，对冬虫夏草分离株进行测序和分析； 37℃恒温反应 1．5h；加 200 LSDS裂解液(100mmol／LNaC1， 分别用苯酚一硫酸法测定虫草多糖，反 向高效液相色谱法测定 50mmo~LTris，10％SDS，pH8．O)，65℃水浴锅 中处理 10min； 腺苷和虫草素。结果将所测得的冬虫夏草分离株 18S一28SrD— 1200g离心 5min，吸取上清后加入等体积氯仿一异戊醇(24：1) NAITS序列与 Genebank数据库进行相似性分析 ，发现与 萃取 5min，离心 ；转移上层水相，加入 0．5倍体积的乙酸铵， AB067721(Hirsutellasinensis，日本)完全相同，与AJ309359 等体积 的异丙醇 ，室温沉淀 20rain；1200g离心 10min，75％ (Hirsutellasinensis，贵州大学)相 比在 544位多一个 G，从分子 的乙醇洗涤沉淀 ；沉淀用 10mmol／LTfis(pH7．6)溶解 。 水平上证 明了该分离株为冬虫夏草 的真正无性型一中国被毛 1．2．1．2 I 区引物设计及 PCR扩增 引物设计 ：PCR扩增 孢 ；菌丝体中虫草多糖 、腺苷和虫草素分别为 16．81％~0．669％， 引物为真核生物ITS扩增通用引物 ITS4和I 5t01，由上海博亚 (342．7~5．20)g幢、(1O-41±l-32)g幢。 生物公司合成 。引物序列为 ：r 4：5一TCCTCCGC1TrATTG 关键词 中国被毛孢 虫草多糖 腺苷 虫草素 分子鉴定 ATArGC一3 ．ITS5：5一GGAAGTAAAAGI℃GTAACAAGG一3 。 文章编号 1000—8357(2009)05—0020—03 PCR反 应体 系 ：5 L 10xSuperTaqbuffer，4 LdNTP 冬虫夏草是我 国传统名贵中药 ，冬虫夏草提取物 已被用 (2．5mmol／L)，0．5 LITS4、ITS5(10mmol／L)弓l物 ，0．6 L 来治疗高血糖症、呼吸系统疾病 、肝病 、肾衰竭[1J，并作为抗癌 SuperTaq，4 L模板 ；反应程序为 ：94℃预变性 5min，进人循 药物和抗氧化剂等弭。冬虫夏草 的主要活性成分包括虫草多 环 ，94℃变性 1rain，55℃退火 1rain，72cc延伸 1rain，30个循 糖，腺苷和虫草素，三者 已被建议作为控制虫草质量 的标准 。 环 ，最后 72℃延伸7rain。取 lO L反应产物进行0．8％琼脂糖 目前，与冬虫夏草有关的无性型菌种已报道有 22个学 凝胶电泳检测 。PCR扩增产物直接进行测序 ，由Invitrogen公