干扰FLT3基因表达对急性骨髓系白血病细胞活性影响.docVIP

干扰FLT3基因表达对急性骨髓系白血病细胞活性影响 　　[摘要] 目的 利用RNAi技术干扰FLT3基因，研究其对髓系白血病细胞（HL-60）活性的影响，进而探讨利用RNAi技术靶向治疗急性骨髓系白血病(AML)的可能性。方法 以NC(HL-60细胞)和HK(含shRNA-FLT3的阴性对照的HL-60细胞)、F1(实验组，含shRNA-FLT3的HL-60细胞本实验室已实验证明对FLT3有干扰作用)3种细胞株为研究对象。实验分2组，每组皆包括NC、HK和F13种细胞株：1)药物组：LY294002(PI3K通道阻断剂)作用组。2)对照组：未加LY294002。MTT和流式细胞术(FCM)分别测定细胞活性和细胞凋亡率的变化。结果 1)药物组、对照组组内比较：以NC做参照，F1能使细胞活性下降，细胞凋亡率增加，差异具有统计学意义(P0.05)。2)药物组与对照组组间相比，药物组的细胞活性下降，细胞凋亡率增加，差异均有统计学意义(P 　　[关键词] siRNA； FLT3； PI3K； LY294002； HL-60 　　[中图分类号] R733.71 [文献标识码] A [文章编号] 1005-0515（2011）-12-334-01 　　 FLT3(Fms-liketyrosinekinase3)即FMS样酪氨酸激酶3属于Ⅲ型受体酪氨酸激酶(RTKⅢ)家族。近年研究发现，FLT3基因突变与急性髓系白血病(AML)的发生、预后有关，StirewaltDL等[1]研究表明，FLT3基因发生突变，有可能破坏正常血细胞的增殖分化与凋亡，导致白血病发生。目前FLT3基因突变类型主要有两种，内部串联复制(internaltandemduplication，ITD)和酪氨酸激酶结构域点突变。FLT3/ITD突变见于AML各亚型，但突变率不同。比较一致的观点是M3、M5的发病率高，M2、M6的发病率低。在正常造血细胞(包括高表达FLT3的脐带血和骨髓细胞)中未检测到FLT3/ITD。MunozL等[2]报道FLT3/ITD在急性淋巴细胞白血病(ALL)中罕见。至今未发现白血病以外的肿瘤细胞有FLT3表达[3]，所以FLT3是白血病的特异性标志。本实验利用RNAi技术，靶向干扰AML细胞(HL-60)的FLT3基因，首先证实了LY294002可以抑制HL-60细胞活性，促进细胞凋亡；同时对细胞实施FLT3-shRNA干扰，通过检测细胞活性和凋亡率，探讨基因靶向治疗急性髓系白血病的可能性。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 HL-60细胞、shRNA-FLT3载体、LY294002抑制剂。 　　1.2 细胞培养和传代 取复苏细胞悬于含20%胎牛血清的1640培养液中，37℃，5%CO2、饱和湿度的温箱中培养1-7天。 　　1.3 shRNA-FLT3表达载体转染HL-60细胞 　　1.4 实验分组 实验分为两组:①药物组：HL-60、HK、F1三种细胞，培养基中加入20μg/ml抑制剂LY294002，标号分别记为NC(+)、HK(+)、F1(+)；②对照组：不加LY294002，仅加入同体积DMSO。标号分别记为NC(-)、HK(-)、F1(-)。 　　1.5 FCM检测细胞凋亡 取1×106待测细胞用1×Binding缓冲液重悬细胞，再将5μL的AnnexinV-FITC和10μL的PI加入细胞悬液中，用流式细胞仪检测细胞凋亡。 　　1.6 MTT检测细胞活性 　　1.7 统计学处理 实验数据均以x±s表示，以≤0.05作为检验水准。以SPSS17.0统计软件进行t检验。 　　2 结果 　　2.1 药物组和对照组细胞活性的变化 ①对照组和药物组组内：F1吸光值的表达明显均低于NC、HK(P0.05)；②药物组和对照组组间：NC(+)和NC(-)、HK(+)和HK(-)、F1(+)和F1(-)，药物组吸光值的表达均低于对照组，差异有统计学意义(P0.05)，见表1。 　　 　　2.2 药物组和对照组细胞凋亡的变化 FCM检测细胞凋亡:①对照组和药物组组内：F1凋亡率的表达均高于NC、HK(P0.05)；②药物组和对照组组间：NC(+)和NC(-)、HK(+)和HK(-)、F1(+)和F1(-)，药物组凋亡率均高于对照组，差异有统计学意义(P0.05)，见表2。 　　 　　3 讨论 在我国，白血病是十大高发的恶性肿瘤之一。尽管现在有化疗，手术治疗等多种方法来治疗白血病，但其病死率仍居高不下。化学疗法仍是现在治疗白血病的主要手段，但其巨大的毒副作用常常使患者不能忍受，也严重的影响着人们的生活质量，骨髓移植因其配型的困难以及高额的医疗费用，成为其治疗白血病的最大缺点。FLT3是急性髓系白血病(AML)治疗的理想