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2018-05-28 发布于上海
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lass2tmsg1基因过表达对人肺癌细胞的影响-effects of overexpression of las s2 tmsg 1 gene on human lung cancer cells

目录中文摘要1Abstract 3前言5第一部分LASS2/TMSG-1 基因对人肺癌 95D 细胞增殖、侵袭、迁移功能影响的研究一、实验设备及试剂 61. 实验仪器及耗材62. 实验试剂及配制7二、实验方法及内容91. 质粒 DNA 提取92. 细胞培养 113.western blot134. 细胞免疫组化155. 细胞增殖实验（MTT）166.细胞侵袭实验（transwell ）167.细胞迁移实验（细胞划痕修复）17三、实验结果171. 数据统计分析172. 实验结果及结论17四、讨论22第二部分 LASS2/TMSG-1 基因与 V-ATPase 相互作用机制的研究一、实验设备及试剂231. 实验仪器及耗材232. 实验试剂及配制23二、实验方法及内容24 1. LASS2/TMSG-1 基因与 ATP6L 的关系242. LASS2/TMSG-1 基因对 V-ATPase 的影响 263. LASS2/TMSG-1 基因与 MMP-2、MMP-9 的关系 27三、实验结果281. 数据统计分析282. 实验结果及结论28四、讨论33参考文献36文献综述41结论47参考文献48缩略语表50攻读学位期间发表文章情况51攻读学位期间科研情况51个人简历52致谢53中文摘要目的探讨人源性长寿保障基因 2（homo sapiens longevity assurance homologue2， LASS2 即 TMSG-1）对人肺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响及其调控机制是否通过影响 V-ATP 酶而实现。方法为探讨 LASS2/TMSG-1 基因对人肺癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响及其作用机制，本课题实验采用人肺巨细胞癌高转移潜能细胞亚系 95D 细胞，课题内容分为两部分，第一部分研究 LASS2/TMSG-1 基因对人肺癌细胞 95D 生物学功能的影响：将前期已构建好并冷冻保存的 PcDNA3-TMSG-1 质粒通过脂质体转染法瞬时转染入细胞，使外源性 LASS2/TMSG-1 基因在细胞内过表达即 LASS2/TMSG-1 group，同时设立转染空白质粒的 negative group 和没转染质粒的 untreated group。通过 western blot、细胞免疫组化鉴定转染效率和表达情况；MTT 实验、trans well 及细胞划痕修复实验检测 LASS2/TMSG-1 基因对人肺癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响。第二部分探讨 LASS2/TMSG-1 基因与质子泵 V-ATPase 相互作用的机制：通过 western blot、PCR 检测该基因对 ATP6L 表达活性的影响；通过 V-ATPase 活性检测实验、细胞外 H+浓度检测实验探讨该基因对质子泵 V-ATPase 的活性的影响；通过 western blot、明胶酶谱、细胞分泌 MMP2/9 检测实验探讨该基因对基质金属蛋白酶 2/9 的表达和分泌活性的影响。结果第一部分的体外生物学功能实验结果表明 LASS2/TMSG-1 group 95D 细胞的增殖（P＜0.05）、侵袭（P＜0.05)和迁移（P＜0.05）能力均低于另外两组且差异具有统计学意义，说明 LASS2/TMSG-1 基因能抑制人肺癌细胞 95D 的增殖、侵袭和迁移，初步推断该基因是一种肿瘤转移抑制基因。第二部分机制探讨的实验结果显示 LASS2/TMSG-1 group 的 ATP6L 表达活性降低（P＜0.05），细胞分泌 V-ATPase 活性降低（P＜0.05），细胞外 H+浓度降低（P＜0.05），基质蛋白水解酶的表达及活性均降低（P 均＜0.05），提示 LASS2/TMSG-1 基因可能与质子泵 V- ATPase 相互作用，通过调控 V-ATP 酶的 C 亚基 ATP6L 来抑制肿瘤细胞的侵袭转移。结论综上所述，本实验研究证实了 LASS2/TMSG-1 基因可以抑制人肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，其机制可能是 LASS2/TMSG-1 基因与质子泵 V- ATPase 结合后调控 C 亚基上的 ATP6L，使其表达活性降低，导致质子泵 V- ATPase 活性降低、泌 H+减少，基质金属蛋白酶活性降低，对细胞外基质的降解减少，从而抑制肿瘤细胞的侵袭转移。但 LASS2/TMSG-1 基因调控肿瘤细胞凋亡的机制及途径尚不清楚，有待进一步研究。关键词：LASS2/TMSG-1 基因，肺癌，增殖侵袭迁移，机制Effects of LASS2/