广西虎纹捕鸟蛛毒素成分研究及对人脑胶质瘤u251细胞的作用机理分析-study on toxin constituents of ornithopterus huwen from guangxi and its mechanism of action on human glioma u251 cells.docxVIP

PAGE PAGE 10英 文 缩 略 词HWZD 虎纹蛛粗毒HWTX-Ⅰ 虎纹毒素-ⅠHWTX-Ⅱ 虎纹毒素-ⅡU251 人脑胶质瘤细胞DEPC 焦碳酸二乙脂β-actin β-肌动蛋白DMSO 二甲基亚砜EB 溴乙锭PBS 磷酸盐缓冲液EDTA 胰蛋白酶HEPES 4-羟乙基哌嗪乙磺酸KCl 氯化钾KH2PO4 磷酸氢钾MTT 四甲基偶氮唑蓝NaCl 氯化钠NaHPO4.12H2O 磷酸氢钠DMEM 杜氏改良培养基RT-PCR 反转录聚合酶链式反应mRNA 信使核糖核酸PCR 聚合酶链式反应IC50 半数抑制率Bax BcL-2 相关 X 蛋白基因（促进凋亡的蛋白基因）Bcl-2 B 细胞淋巴瘤/白血病-2（抗凋亡的蛋白基因）Caspase-3 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶中 文 摘 要目 的： 通过对广西虎纹捕鸟蛛毒成分进行氨基酸测定，以及红 外、紫外光谱法定性分析，初步鉴定蛛毒的化学成分；并对其药理作 用作体外实验，研究毒素对人胶质瘤细胞的凋亡的影响，以及对细胞 中 Caspase-3 和 Bcl-2/Bax 的表达影响。方 法： 1 化 学 成 分 的 初 步 定 性 分 析 采用氨基酸自动分析 仪对蛛毒的多种氨基酸成分进行定性及定量的研究，并且辅以紫外、 红外光谱法进行定性研究，初步鉴定蛛毒的化学成分。2 抗 肿 瘤 活 性 的 研 究 采用 MTT 法、流式分析法、Caspase-3 活性测定法测定 HWZD 对 U251 人脑胶质瘤细胞的增殖作用的影响。3 HWZD 对 U251 人脑胶质瘤细 胞 凋 亡 相 关 基 因 表 达 的 影 响 采用 RT- PCR 技术 测定 HWZD 对 U251 人脑胶质瘤细胞抑癌基因 bax，癌基因 bcl-2 表 达的影响。结 果： 1 采用氨基酸自动分析仪对蛛毒的多种氨基酸成分进行 定性及定量的研究，结果表明该鉴别方法操作简便、专属性强，可用 于蛛毒的定性鉴别和含量测定；利用紫外-可见光谱、红外光谱法对 蛛毒样品进行光谱鉴别研究，显示蛛毒具有一定的光谱特征。2 MTT 法表明HWZD对U251细胞均有显著抑制作用(P＜0.05或P＜0.01)，具 有剂量依赖性。HWZD剂量为37.5、50、75、100、150mg/L时，对U251 细胞的增殖有显著性抑制作用(P＜0.05或P＜0.01)，IC50为53.48 mg/L。 流式细胞仪分析法表明HWZD对U251细胞具有显著性凋亡作用，并 有浓度依赖和时效关系。在剂量为150 mg/L，并诱导48h，细胞早期 凋亡率84.1%，晚期凋亡率4.48%。Caspase-3活性测定表明HWZD在 150 mg/L时对细胞中的执行分子Caspase-3的激活速度快，活化程度为9.23并存在剂量依赖关系。3 HWZD 在浓度为50、75、100 mg/L时均 显著增强基因bax的表达水平(P＜0.05或P＜0.01)。HWZD 在浓度为50、75、100mg/L时均显著降低癌基因bcl-2的表达水平(P＜0.05或P＜0.01)。结 论 ： 1 初步建立了HWZD成分的定性鉴定研究方法；2 HWZD 对U251细胞株的增殖有明显的抑制作用；3 HWZD能够显著增强抑癌 基因bax的表达，其抗肿瘤作用可能与上调bax表达相关；HWZD能够 显著降低癌基因bcl-2的表达，其抗肿瘤作用可能与下调癌基因bcl-2 表达相关。 关键词 ：HWZD；氨基酸测定；光谱分析；细胞凋亡；Caspase-3； bax、bcl-2 基因；Identify the Chemical Elements of Spider Toxins Through Amino Acid Test on Guangxi Selenocosmia Huwena Toxin Contents and of Mechanism HWZD to the Gene Expression of U251 Apoptosis of A HumanBeing’s Brain Gliocytoma ABSTRACTObjective：To identify the chemical elements of spider toxins throughamino acid test on Guangxi Selenocosmia Huwena Toxin contents and the analysis on its infrared and ultrav