海洋嗜杀酵母wickerhamomyces anomalus yf07b菌株新型嗜杀因子的分析-analysis of novel killer factors of marine killer yeast wickerhamomyces another us yf07b strain.docxVIP

中国中国海洋大学硕士学位论文II海洋嗜杀酵母 Wickerhamomyces anomalus YF07b 菌株新型嗜杀因子的研究 摘 要嗜杀因子(Killer toxin)是一些酵母菌分泌的具有抗微生物活力的外毒素，它 们一般是分子量较小的蛋白质或者糖蛋白，通常首先作用于敏感酵母的细胞壁， 可以不通过细胞接触而杀死一些同种或亲缘关系较近的酵母菌。能够产生嗜杀因 子的酵母菌称为嗜杀酵母(Killer yeasts)，它们对自己所产生的嗜杀因子具有免疫 性；能够被嗜杀酵母杀死的菌株称为敏感菌株；既不能被其他嗜杀酵母菌株杀死 也不能杀死其他菌株的酵母称之为中性酵母。海洋酵母Wickerhamomyces anomalus YF07b菌株是一株从海鞘（Sea squirts） 肠道中分离的嗜杀菌株，具有较广的杀菌谱，其分泌的嗜杀因子可以杀死梭子蟹―乳化病‖的病原菌梅奇酵母（Metschnikowia bicuspidata) WCY 菌株。 通过对海洋嗜杀酵母W. anomalus YF07b菌株产嗜杀因子的培养条件和嗜杀因子最适作用条件的优化，确定了产嗜杀因子的最佳培养条件：pH为3.5，NaCl 的浓度为 2.0% (w/v)，在 20°C 条件下 180rpm 振荡培养 3d；嗜杀因子作用的 最佳条件：pH3.5，NaCl 的浓度为 4.0% (w/v)，作用温度为 16°C。曾有研究发 现海洋嗜杀酵母W. anomalus YF07b菌株可以产生一种分子量为 47.0kDa 的嗜 杀因子，该嗜杀因子既有嗜杀活性又有β-1,3-葡聚糖酶活性。但是在本研究中通 过发酵上清液的制备、发酵上清液透析、DEAE-Sephorose Fast Flow阴离子交换、 超滤浓缩、Sephadex G-75凝胶过滤层析、超速离心浓缩和SDS电泳等步骤 分离纯化出一种分子量约为 67.0kDa 的嗜杀因子，并且该纯化的嗜杀因子只具 有嗜杀活性没有β-1,3-葡聚糖酶活性，所以本研究中纯化出的嗜杀因子是一种新 型 的 嗜 杀 因 子 。 纯 化 的 新 型 嗜 杀 因 子 对 Yarrowia lipolytica, Saccharomyces cerevisiae, M. bicuspidata WCY, Candida tropicalis, Candida albicans 和 Kluyveromyces aestuartii具有嗜杀作用，在 pH 3.5 和 NaCl 浓度为 4.0%(w/v)的IIII嗜杀活性检测平板上在 16°C 培养条件下对敏感菌株 WCY 的嗜杀活性最强。对纯化的新型嗜杀因子的嗜杀机理进行初步探究：纯化的嗜杀因子不能杀死 WCY 菌株的原生质体，却可以杀死完整的 WCY 菌株细胞，说明该嗜杀因子发 挥嗜杀作用需要完整的细胞壁；吸附试验表明该嗜杀因子的初始结合位点存在于 敏感酵母的细胞壁上；扫描电镜结果显示纯化的嗜杀因子可以破坏敏感酵母 WCY 细胞壁的完整性；荧光检测结果显示纯化的嗜杀因子能破坏敏感酵母 WCY 菌株细胞膜的通透性。推测纯化的新型嗜杀因子作用方式为：嗜杀因子与 细胞壁上受体结合后转位至细胞膜，然后与细胞膜上的受体相互作用，破坏细胞 膜的完整性，最终使细胞裂解死亡。 关键词：海洋嗜杀酵母；病原酵母菌；最佳作用条件；嗜杀因子；嗜杀机理 PAGE PAGE IVA novel killer toxin produced by the marine-derived yeastWickerhamomyces anomalus YF07b AbstractKiller toxin is the antimicrobial exotoxin that is produced by many killer yeastsand is usually the protein or glycoprotein with small molecular mass. Killer toxin usually combines with the first receptors on the sensitive yeast cell walls and kills the sensitive yeast indirectly. The killer strains are insensitive to their own toxins, but remain susceptible to the toxins secreted by other killer yeasts.The marine yeast Wickerhamomyces anomalus YF07b was isolated from the