白木香法呢基焦磷合酶基因AsFPS1克隆及表达分析.docVIP

白木香法呢基焦磷合酶基因AsFPS1克隆及表达分析 　　[摘要]法呢基焦磷酸合酶（ FPS） 是倍半萜代谢途径中的关键限速酶之一。本研究在454高通量测序已获得的cDNA序列基础上，PCR扩增其开放阅读框并测序验证；提取三年生白木香根、茎、叶的总RNA及健康和伤害处理的愈伤组织的总RNA，以反转录成的单链cDNA为模板进行荧光定量PCR，检测AsFPS1基因的组织表达特异性及对伤害处理的反应。结果表明，扩增到的AsFPS1基因全长1 342 bp，开放阅读框1 029 bp，编码342个氨基酸。组织表达分析的结果显示，AsFPS1基因主要在根和茎中表达，叶中的表达量较低；该基因同时受物理伤害和结香液处理的诱导，分别在6，12 h达到最高表达水平。通过AsFPS1基因全长cDNA的克隆和表达分析，为后续研究其生物功能及沉香倍半萜合成机制奠定了基础。 　　[关键词]白木香；FPS基因；克隆；表达分析 　　沉香是一种高级香料，更是一种名贵中药材，在我国传统中医学、藏医学和印度传统医学中已有几千年的沿用历史。具有行气镇痛、温中止呕、纳气平喘等功效。白木香Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg为瑞香科沉香属植物，是我国生产沉香的唯一正品植物来源。但是健康白木香树不能产生沉香，只有当树体受到损伤或刺激的情况下才能产生。由于沉香的高价值，白木香野生资源遭到严重破坏。2004年，白木香被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录II [1]。 　　研究表明，沉香倍半萜类物质是沉香药材的主要化学成分之一[2-3]。倍半萜类物质是由法呢基焦磷酸分子在倍半萜环化酶的催化下，经环化后进一步衍生而成。法呢基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophosphate synthase， FPS）是一种异戊烯基转移酶，催化萜类代谢五碳基团IPP和其同分异构体DMAPP连续的头尾缩合反应，形成法呢基焦磷酸（FPP）。FPP是植物甾体、倍半萜植保素、三萜皂苷、蛋白质异戊烯基侧链以及传递呼吸链底物的侧链基团等众多萜类衍生物的合成前体，这些物质在植物生长发育和防御反应中起重要作用[4-6]。利用酵母功能缺失-互补系统或利用PCR克隆技术，分别从拟南芥[7-9]、水稻[10]、青蒿[11]、辣椒[12]、扁豆[13]、橡胶树[14]、棉花[15]和紫穗槐[16]中分离了数个FPP合酶的cDNAs。序列分析表明，植物FPP合酶的氨基酸序列同源性高达70%以上，同细菌、酵母或哺乳动物的FPP合成酶一样，具有2个高度保守的天门冬氨酸区域，编码30～40 kDa的蛋白分子。在动物中，FPP由12～15个基因组成的基因家族编码，但植物FPP合成酶只有1个或2个基因编码。本文根据课题组前期得到的白木香转录组信息，对白木香FPS1 的cDNA序列进行克隆、生物信息学分析，并进行组织表达特性和伤害处理下的表达特性分析。本研究将有助于进一步了解倍半萜类物质的生物合成途径及其调控机制，为高效结香技术的建立奠定基础。 　　1材料 　　中国医学科学院药用植物研究所温室栽培的三年生白木香的根、茎、叶用于提取总RNA，检测AsFPS1基因的组织表达特异性。三年生白木香茎诱导产生的愈伤分别进行物理伤害和结香液处理，于处理后6， 12， 24 h 取样，用于提取总RNA，检测AsFPS1基因在健康和伤害愈伤组织中的表达差异。 　　2方法 　　2.1RNA提取和cDNA合成 利用RNA纯化试剂盒（Norgen， Canada）提取RNA。1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，利用NanoDrop2000 进行浓度测定。利用TaKaRa公司PrimeScript反转录酶将总RNA 反转录为第一链互补链DNA （cDNA）。反转录的反应条件及程序均按照TaKaRa 公司的 PrimeScript 反转录试剂盒说明书进行。 　　2.2AsFPS1基因的克隆 根据454高通量测序的结果，拼接到1条长1 342 bp的序列，分析发现，该序列具有完整的开放阅读框（ORF），长1 029 bp，命名为AsFPS1。利用Primer 5 软件设计ORF全长鉴定引物，AsFPS1-f：5′-ATGGCGGATCTCAGATCGAC-3′；AsFPS1-r： 5′-TTACTTC TGCCTCTTGTAGATTTTCC-3′。取1 μL反转录的模板，利用保真性高的TaKaRa LA 酶进行扩增。PCR扩增体系为超纯水33 μL， 引物AsFPS1-f和 AsFPS1-r 引物各1 μL，cDNA 链模板 1 μL， LA Taker 1 μL，10x LA buffer 5 μL，dNTP （2.5 mmol·L-1） 8 μL。PCR扩增程序为94 ℃预变性5 min；然后98 ℃