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白脉散有效成分组调控神经干细胞增殖实验研究 　　[摘要] 神经干细胞（NSCs）具有替代及修复受损神经组织的作用，研究发现能够通过调控NSCs内环境诱导其增殖分化，重塑神经功能，从而修复脑卒中神经病变等神经系统损伤。本实验研究了蒙药白脉散有效成分组（BMECG）激活NSCs增殖的药理学作用。通过建立体内外2种损伤模型，模拟脑卒中神经病变，分别利用流式细胞术、行为学检测、Nestin免疫组化等方法研究BMECG的脑保护作用机制。结果表明，BMECG能够显著提高体外培养NSCs增殖能力，有助于小鼠的行为学功能恢复，明显改善模型小鼠大脑皮层NSCs增殖能力。因此BMECG直接针对NSCs增殖存活能力发挥作用，可能是治疗脑卒中神经病变的机制之一，该药物具有重要的研究意义和广阔的应用前景。 　　[关键词] 白脉散；有效成分组；神经干细胞；脑卒中；羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯染色法 　　[收稿日期] 2013-04-18 　　[基金项目] 国家自然科学基金面上项目 　　[通信作者] *陈小玉，E-mail：xiaoyu0767@163、com 　　[作者简介] 刘庆山，Tel/Fax：（010E-mail： nlqsh@163、com “有效成分组”是指复方中与治疗目的密切相关的活性成分的总和，是传统复方现代化的重要指导理论之一[1]。白脉散有效成分组（Baimai effective compounds group， BMECG）是课题组在“复方有效成分组”理论指导下从蒙药经典方剂白脉散中获得的“组分中药”，由人参皂苷Rg1、胡黄连苷II、牛磺酸等组成，成分清楚，质量可控[2-3]。白脉散源自《四部医典》，临床可用于治疗白脉病等病症[4]，为发挥民族药大复方多组分、多靶点的特点，对其有效成分进行深入研究，研究BMECG对脑卒中神经病变的作用和机制，本研究采用体外实验及整体实验，对BMECG影响NSCs的作用进行了研究。 　　1 材料 　　1、1 动物 　　一日龄Wistar大鼠，SPF级，购自北京维通利华有限公司，许可证号SCXK（京）2006-0008；健康雄性昆明小鼠，SPF级，体重（20±2） g，购自北京维通利华有限公司，许可证号SCXK（京）2009-0017。 　　1、2 药品 　　人参皂苷Rg1（纯度98%，昆明双星科技开发有限公司），胡黄连苷Ⅱ（纯度90%，南京景竹生物科技公司），白脉散有效成分组为本实验室自制，由人参皂苷Rg1、没食子酸、胡黄连苷II、牛磺酸等成分按照质量百分比33%，30%，33%，4%组成。 　　1、3 试剂 　　胎牛血清（澳大利亚进口，浙江天航生物科技有限公司分装）；DMEM/F12培养基、神经干细胞培养添加剂B27 （Gibco公司）；重组牛碱性成纤维生长因子bFGF （珠海亿胜生物制药有限公司）；MAP-2兔抗鼠一抗、Nestin兔抗鼠一抗（Sigma公司）；CFDA-SE试剂盒（碧云天生物技术研究所）；FITC标记山羊抗兔二抗（北京中衫金桥生物技术有限公司）；DAB显色试剂盒、Mayor苏木素（武汉博士德生物工程有限公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG （碧云天生物技术研究所）；其余试剂均为市售分析纯。 　　1、4 仪器 　　ZB-200平衡转棒仪（成都泰盟软件有限公司）；超净工作台（北京医疗设备厂）；CB150二氧化碳培养箱（德国Binder）；HERAcell 150三气培养箱（美国Thermo公司）；流式细胞仪（FACSCalibur， BD公司，美国）；IX81自动型倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；5804R型低速冷冻离心机（德国艾本德公司）。 　　2 方法 　　2、1 体外NSCs氧糖剥夺/复供增殖模型的制备 　　2、1、1 原代培养大鼠NSCs 取一日龄新生大鼠，以75%乙醇浸泡灭菌，置于无菌工作台中冰上操作。取出大脑皮层置于4 ℃PBS中，剥离血管和脑膜后置于小西林瓶中加2 mL培养基剪成泥状，用吹打法分散细胞，200目钢筛过滤。1 000 r?min-1离心5 min，弃上清，加入 DMEM/F12完全培养基（含bFGF 50 μg?L-1，2%B27），吹打成细胞悬液。0、4%台盼蓝计数，调整细胞密度，按5×105个/mL接种于25 cm2细胞培养瓶中。置于37 ℃，5%CO2培养箱中悬浮培养，待NSCs形成克隆球后适时传代[5]。首先利用NSCs特异性表面标记物巢蛋白（Nestin）按常规免疫荧光实验方法进行鉴定。给药后每天选取6个不同视野，在倒置显微镜下拍照，最后应用Image-Pro-Plus 6、0软件进行处理，观察克隆球数目变化及直径计算其增殖能力。 　　培养3～4 d后，培养基中可见桑葚样的细胞克隆聚集物