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酵母基因组及其线粒体基因组提取方法比较 　　摘要：通过比较多形汉逊酵母基因组及其线粒体基因组的提取方法，获得一种简便、快速、高效、合适、成本低的提取方法。本文以多形汉逊酵母为研究对象，分别采用试剂盒法、酶解法和LiOAC/SDS/玻璃珠组合法提取多形汉逊酵母基因组及其线粒体基因组DNA，进而运用核酸凝胶电泳、紫外分光光度计测定DNA浓度及其纯度。结果表明：LiOAC/SDS/玻璃珠组合法具有DNA提取量大、成本低、浓度高；试剂盒法提取DNA纯度较高、质量较好，但是存在提取量小，浓度较低，成本较高等缺点；酶解法浓度一般，纯度差，成本高等缺点。 　　关键词：酵母 线粒体基因组 纯度 　　中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）10-0089-03 　　随着高通量测序技术的快速发展和测序成本的下降，人们已逐步深入到组学的研究水平。其中，由于酵母菌是一类单细胞真核微生物，具有结构简单、易于培养、生长迅速、遗传背景清晰，而且易于接受外源基因，被广泛作为模式生物或细胞工厂，应用于基础研究和应用研究中。这就需要对酵母菌进行基因组DNA分离提取，而基因组DNA的质量是影响高通量测序或分析细胞工厂的重要因素。但是，酵母菌的细胞壁比较厚实，重量约占其干重的30%，结构比较坚韧。细胞壁主要由三层构成，外层以α-1，6糖苷键为骨架和相关支链结合而成的甘露聚糖，内层以β-1，6糖苷键和相关支链结合成的葡聚糖，中间层为丰富的蛋白质分子。如何有效地破坏坚韧厚实的细胞壁是高效提取基因组DNA的重要前提，因而选择一种快速、高效、便捷、经济的提取方法尤为重要。 　　已有文献报道了液氮研磨法[1]、超声法[2]、复合酶法[3]、高压匀浆法[4]等酵母基因组提取方法。上述方法均存在一定的缺点，其中液氮研磨法需要反复冻融，操作过程较复杂，致使基因组DNA损失较多；超声法对细胞壁的破壁效果较差，基因组DNA得率较低；酶解法和高压匀浆法存在成本高，一次提取量较少，不适宜大量基因组DNA的提取。本实验通过对试剂盒法、酶解法、自行设计的LiOAC/SDS/酸洗玻璃珠法进行比较，获得一种简便、成本低、高效的基因组和线粒体基因组DNA的提取方法???为其相关组学研究提供前提条件。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料与仪器 　　多形汉逊酵母（H.polymorpha）DL-1菌株（ATCC No.26012）； 　　YPD固体培养基（g/L）：葡萄糖20g；蛋白胨20g；酵母膏10g；琼脂粉15g，pH6.5，121℃灭菌20min； 　　种子液培养基（g/L）：葡萄糖20g；蛋白胨20g；酵母膏10g，pH6.5，121℃灭菌20min； 　　发酵液培养基（g/L）：丙三醇15g，（NH4）2SO4 15g，K2HPO4 0.24g，MgSO4?7H2O1.8g，CaCl2 0.28g，NaCl 0.6g，NaNo3 0.58g，FeCl3SO4?6H2O 0.006g，硫胺素盐酸盐0.004g，微量元素母液1ml。 　　微量元素母液（mg/L）：Na2MoO4?2H2O 484mg，MnSO4?H2O 176mg，KI 207.5mg，CuSO4?5H2O 40mg，ZnSO4?7H2O 40mg，pH为6.5。 　　酵母浸粉、蛋白胨、琼脂粉、醋酸锂、葡萄糖、氯化钠、氯仿、乙醇等分析试剂购自天津市科密欧化学试剂有限公司；琼脂糖、Tris-Hcl、十二烷基硫酸钠（SDS）、EDTA 、DNeasy Plant Mini Kit、Tris饱和酚等试剂购自美国Sigma公司。 　　台式冷冻离心机（美国Sigma公司）、漩涡混合仪（美国LABNET）、Bio-Rad SmartspecTMplus分光光度计、Bio-Rad DNA电泳仪、凝胶成像分析系统（美国Alpha-2200），超净工作台、高压灭菌锅、恒温摇床（上海智城分析仪器有限公司）。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 酵母基因组的提取 　　（1）改良DNeasy Plant Mini Kit试剂盒法。取酵母悬浮液1.5mL，8000r/min离心10min，弃去上清液后，加入100μL酸洗玻璃珠（直径0.5mm）和100uL细胞裂解液混匀后，置于漩涡振荡器上振荡10min后，离心8000r/min离心10min。将上清液转移到另一EP管中，加入2μL RNaseA和200uL BufferAP1混匀后，放入70℃水浴锅中孵育20min，期间上下摇匀3-4次后加入65uL Buffer P3混匀。然后放入-20℃冰箱中静置30min后，4℃条件下12000r/min离心10min。将上清液转移至QIA shredder spin柱子中，12，000r