酿酒酵母spc29p磷酸化对n-sfi1p与spc29p之间相互作用的影响-effect of phosphorylation of saccharomyces cerevisiae spc 29 p on the interaction between n - sfi1p and spc 29 p.docxVIP

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2018-07-27 发布于上海
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酿酒酵母spc29p磷酸化对n-sfi1p与spc29p之间相互作用的影响-effect of phosphorylation of saccharomyces cerevisiae spc 29 p on the interaction between n - sfi1p and spc 29 p

独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日中文摘要在酿酒酵母细胞中，纺锤体极体(spindlepolebody,SPB)是它的微管组织中心，在维持细胞遗传稳定性上发挥着极其重要的作用，与高等动物细胞的微管组织中心即中心体有着很多同源的蛋白组分，高度保守和相似的复制和分离调控机制，已经成为中心体复制与分离研究的模式细胞器。SPB由SPB主体和半桥两部分组成。Sfi1p是SPB必需的半桥蛋白，缺失或突变会导致SPB复制失败，对SPB正常功能的维持具有十分重要的作用，并且在人类中心体中也存在其同源蛋白hSfi1p。Spc29p是构成SPB中央斑块的必需卷曲螺旋蛋白，是SPB主体蛋白组分，限制温度下Spc29p的温度敏感突变会导致SPB无法复制。实验室前期的研究结果表明Spc29p与Sfi1p的N端之间存在强烈的相互作用，这对于早期的SPB的复制是非常重要的，第一次揭示了SPB主体和半桥之间有直接的联系。Spc29p在4个磷酸化位点T18、T159、S187和T240处被蛋白激酶Mps1p磷酸化。本论文对Spc29p的磷酸化对其与N-Sfi1p之间相互作用的影响进行了初步研究，并进一步探讨了Spc29p磷酸化对SPB自我组装过程的影响。该研究为SPB复制过程的深入研究提供了科学指导，也对人类中心体的相关研究具有重要的借鉴意义。本文通过融合PCR、定点诱变技术及其他克隆手段对SPC29磷酸化位点处的基因序列进行修饰，构建出处于消除磷酸化状态的突变质粒pGAD424-spc29-T18A、-T159A、-S187A和-4A以及处于模拟磷酸化状态的突变质粒pGAD424-spc29-T18D、-T159D、-S187D和-4D，经过测序分析正确，另外，包括实验室收藏的质粒pGAD424、pGBT9、pGAD424-SPC29、pGBT9-SPC29、pGBT9-SFI1-NT(1-250)，及质粒pGAD424-spc29-T240A、-T240D。将携带有SFI1-NT的BD载体pGBT9和携带有SPC29或spc29各等位基因的AD载体pGAD424共同转化酵母菌PJ69-4a。通过酵母双杂交实验对Spc29p磷酸化机制对其与N-Sfi1p之间相互作用的影响进行了初步研究。实验结果显示模拟磷酸化状态的spc29-4D与SFI1-NT的相互作用与消除磷酸化状态的spc29-4A相比明显降低，表明Spc29p的磷酸化对其与N-Sfi1p的结合有调节作用且为负调控，即Spc29p磷酸化降低了其与N-Sfi1p之间的亲和力，削弱了两者之间的相互作用，进一步影响了SPB主体与半桥之间的结合。因此，Spc29p磷酸化作用可能构成了一种新型的调控酵母细胞SPB复制的作用机制。关键词：酿酒酵母；纺锤体极体；Spc29p；磷酸化；Sfi1pABSTRACTIntheyeastSaccharomycescerevisiaecells,thespindlepolebody(SPB)actsasthemicrotubuleorganizingcenterandplaysanimportantroleincelldivisionandgenomestability.Itsharesanumberofhomologousstructuralcomponentsandregulatorswiththecentrosome,whichismicrotubuleorganizingcenterinthemammaliancells,andsomeparallelsintheprocessoftheirduplicationandseparationcanalsobeseen,whichmakestheyeastSPBausefulmodelforstudyingtheprinciplesandmechanismsgoverningcentrosomeassemblyandseparation.SPBconsistsoftw