叶绿体atpBrbcL序列分析在核果类果树系统发育研究应用.docVIP

叶绿体atpBrbcL序列分析在核果类果树系统发育研究应用 　　摘要：为重建核果类果树的系统发育，选择桃、李、梅、杏、樱桃各4～5个主要种或变种，共24个基因型，测定了其叶绿体非编码区atpB-rbcL序列。以桂樱为外种群，用PAuP软件计算数据集的得分，Modeltest筛选最佳模型和参数，Mega计算遗传距离、变异，最大简约法构建系统发育树。结果表明，1)atpB-rbcL在核果类果树各组间分子进化速率不同，差异公布不均衡；2)樱桃较其他核果类果树原始；李、梅、杏亲缘关系较近，梅、杏关系最近。核果类果树是一个单系群，由一个共同的祖先沿着2个方向进化，一枝进化为樱桃，另一枝沿不同的途径产生桃、李、梅、杏等核果类果树。 　　关键词：核果类果树；系统发育；atpB-rbcL；分子进化 　　中图分类号：S662　文献标识码：A　文章编号：1009 9980(2010)02-213-08 　　 　　蔷薇科(Rosaceae)李亚科(prunoideae)植物约有200个种，从寒温带到亚热带都有野生种和栽培种的分布，特别是作为果品食用的李、桃、杏、梅、樱桃等核果类果树，分布较广，经济效益显著。由于亲缘关系较近，核果类果树间多可自然杂交，这为园艺新品种的培育与利用提供了广阔的前景和可能，但这也为核果类果树间的分类和系统发育研究带来了极大的网难，被美国学者称为果树界最大的难题(Hardest Puzzle)。核果类果树在生产中具有显著的经济意义，搞清楚核果类间的分类和系统发育问题具有十分重要的意义。国内外不少学者进行了深入的研究，取得了一定的成果，但到目前为止仍然存在一些争议，比如樱桃在核果类果树系统发育过程中的位置、梅的起源等。 　　由于叶绿体基因组较小、单亲遗传、不参加基因重组(即不受选择压力)，且不受基因的重叠、缺失及假基因的干扰，有独立的进化路线，不依赖于其他任何数据即可构建分子系统树、查明植物的进化历史，因此，叶绿体基因组逐渐成为分子进化和分子系统学研究的焦点。其分子水平上的差异明显，为比较进化研究提供了基本的信息支持，同时编码区和非编码区序列进化速率相差较大，适于不同分类阶元的系统发育研究。叶绿体atpB-rbcL区间位于ATP合酶β亚基(atpB)基因和磷酸核酮糖羧化酶大亚基(rbcL)基因之间，有相对较多的信息位点，已被广泛应用于苔藓、球兰、骨碎补科、蓼科、常绿植物、角果木等植物系统发育的研究，并且这个非编码区在维管植物中的功能(rbcL的启动子)也有了很好的证明，但核果类果树中尚未见报道。 　　我们采用5类核果类果树各4～5个基因型，采用atpB-rbcL序列测序方法，来分析其序列进化规律及核果类果树的亲缘关系，为构建系统发育树提供理论依据。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1．1　材料 　　采集桃、李、梅、杏、樱桃早春幼嫩的春梢新叶，用硅胶干燥法保存。样品名称、采集地点及类型详见表1。 　　 　　 　　1．2　DNA提取 　　采用改进CTAB法提取硅胶干燥叶的DNA。 　　 　　1．3　PCR扩增、测序 　　用Chiang1998年公布的引物来扩增叶绿体atpB-rbcL基因间隔区序列，正向引物：atpB：5’-ACATC-KARTACKGGACCAATAA-3’，反向引物：rbcL-l：5’-AACACCAGCT TrRAATCCAA-3′。该引物同样用于PCR产物的直接测序。扩增体系为50μL，含HS r Taq(5U?μL-1)(大连宝生)0.25μL，10xPCR缓冲液(Mg2+free)5μL，MgCl2(25mmol?L-1)3μL，dNTP混合物(各2.5mmol?L-1)4μL，引物(10μmol?L-1)各2μL，模板DNA(10ng?L-1)2μL，ddH2O补足至总体积50μL。 　　PCR扩增在PTC-100TM PCR仪上进行。反应程序为：94℃预变性5min；94℃30s，44℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸5min。取PCR产物5μL，加入2μL6×溴酚蓝上样缓冲液，于1％琼脂糖胶电泳，用上海复日科技FR-200紫外与可见分析装置拍照分析。 　　选取产生单一条带，条带清晰的产物，送上海英俊公司进行PCR直接测序。 　　 　　1．4　序列分析 　　在进行数据分析前将测得的序列在NCBI()上进行Blast相似性搜索，以确保得到的序列为目标序列。加入大叶桂樱(AB111650)序列，作为分析时的外群，用Clustal X 1.8对序列片段进行比对对齐，变异的位点通过测序图进行确认，并进行适当的人工调整。用PAUP 4.068计算数据集得分，Modeltest3.7 Windows版本筛选最佳核酸替代模型和参数，运用分析软件M