应用流式细胞术评价3种口腔合金对L929细胞凋亡影响.docVIP

应用流式细胞术评价3种口腔合金对L929细胞凋亡影响 　　【摘要】目的:对临床常用的3种口腔医用合金（镍铬合金、金合金、钴铬合金），通过流式细胞术来评价3种合金对L929细胞凋亡的影响。方法制备3种合金材料的浸提液, 用浸提液培养L929细胞24h,用AnnexinV-EGFP与PI对L929细胞双染，应用流式细胞技术检测L929细胞的凋亡情况。结果3种材料引起细胞凋亡的顺序由小到大依次是金合金＞钴铬合金＞镍铬合金。结论不同医用口腔合金材料引起L929细胞凋亡表现出差异性,镍铬合金对L929细胞凋亡影响较大，金合金、钴铬合金表现出了良好的生物相容性。 　　【关键词】合金；细胞凋亡；生物相容性 　　 　　 　　【中图分类号】R352 【文献标识码】B 【文章编号】1005-0515(2011)05-0014-02 　　 　　本实验对国内常用的几种医用口腔铸造合金进行了浸提液的制备，与L929细胞联合培养，用AnnexinV-EGFP/PI对L929细胞进行双染，从细胞凋亡方面对L929细胞做了检测和分析，比较了3中不同铸造合金之间的生物相容性，为其在临床中的应用提供了一定依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料和试剂:小鼠成纤维细胞由中国医科大学附属口腔医院中心实验室提供。RPMI-1640培养液(Serva,Germmany)其中含纯牛胎血清，青霉素100μg/ml,链霉素100μg/ml，24孔培养板，50cm??2培养瓶，CO??2培养箱(Heraeus,德国),超净台(苏净集团安泰公司),高速离心机(Sorvall公司，美国)，流式细胞仪（BD公司，美国），AnnexinV-EGFP/PI试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。 　　1.2 实验样品的分组:对照组,空白组。实验组，钴铬合金组（Stellite,上海），金合金组（Heraeus,德国），镍铬合金组 (Stellite,上海)。金属材料成分见表1。 　　表1 金属材料成分 　　 　　 　　合金材料材料组成（Wt%） 　　 　　钴铬合金 Co64.6,Cr29,Mo4.5 　　 　　金合金 Au86.2,Pt11.5,Zn1.5,Ru0.4,Ta0.3,Mn0.1 　　 　　镍铬合金 Ni60-64,Cr19-23,Mo9-11 　　1.3 金属试件制备制作半径5mm、厚1mm的圆形蜡片（面积1.88cm??2），根据不同合金的要求铸造形成圆形金属片，打磨抛光后超声清洗15分钟；去离子水冲洗数遍（大于3遍）后置于玻璃小瓶中，将金属片于121℃高压灭菌后待用。 　　1.4 实验方法: 　　1.4.1 浸提液制备无菌下将各金属圆片置于24孔板中，每孔1金属片加2ml含10％胎牛血清RPMI 1640培养液，同时设立阴性对照，在37℃、5％CO??2 条件下连续浸提72小时后待用。 　　1.4.2 细胞培养及细胞传代：L929细胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640细胞培养基于50ml培养瓶中在37℃、5％的CO??2培养箱中培养。约3～4天进行细胞传代。当培养细胞密度约70～80％时传代。弃培养瓶中培养液，加0.25％胰酶中和残余培养液后倒掉胰酶，再次加少量胰酶消化贴壁细胞2～3分钟，向培养瓶中加10ml培养液并轻轻吹打瓶壁使细胞脱落，按1：3比例传代培养于50ml培养瓶中。 　　1.4.3 凋亡检测待培养细胞密度约30～40％时将各材料浸提液（包括阴性对照）各4ml加于培养瓶中，37℃、5%CO??2条件下培养细胞24h后将培养瓶中的培养液移入离心管；加lml胰酶中和剩余培养液后移入离心管；加少量胰酶消化2～3分钟；培养瓶中加PBS 5ml 并用滴管轻轻吹打瓶壁使细胞脱落；将细胞悬液移入离心管；4℃、1000转离心5分钟；弃上清后加10mlPBS重悬；计数细胞并取1x106个细胞移入EP管。将500μL Binding Buffer加入Ep管重悬细胞；避光下加5μL AnnexinV-EGFP轻轻混匀;加5μLPI并轻轻混匀；室温下避光15分钟后上机检查。 　　1.5 统计学分析所有计量资料以均数±标准差表示，使用SPSS13.0统计软件对结果进行统计学分析。采用单因素方差分析进行统计学分析。 　　2 结果 　　2.1 细胞凋亡检测结果:从流式细胞仪检测的数据中可以的得出，阴性对照组细胞凋亡率最低，其他依次其他组别为：金合金、钴铬合金、镍铬合金。镍铬合金组表现的生物相容性最差。见表3。 　　表2 细胞凋亡率 　　 　　 　　实验分组 细胞凋亡率（%） 　　 　　阴性对照 2.15±0.60 　　 　　金合金 2.46±0.42 　　 　　钴铬合金 3.20±0.61