重症肌无力易受累肌群乙酰胆碱受体的实验分析-experimental analysis of acetylcholine receptors in vulnerable muscle groups of myasthenia gravis.docxVIP

中文摘 中文摘要 万方数据 万方数据 1.免疫荧光法观察各组肌肉中乙酰胆碱受体的形态 雄性 SD 大鼠 300g， 用 10%水合氯醛，0.7ml/100g（腹腔注射）麻醉大鼠，待麻醉完全后，取出腓 肠肌、前肢肌、咀嚼肌、胸锁乳突肌、眼外肌、肋间肌、膈肌、心肌共 8 组肌 群，分别标记为 A、B、C、D、F、G、H、P 组。各肌群肌肉组织标本先放入 冰 PBS 缓冲液中洗涤两次，然后用 4%多聚甲醛固定 10min，放载玻片上显微 镜下剥离出单根肌丝，PBS 缓冲液洗 5min*3 次，用 5%BSA 固定 60min。倾去 BSA 即可，直接滴加稀释浓度为 1：200 的 SV2 和 2H3 染色，37℃孵育 60min。 PBS 缓冲液洗 5min*3 次，加入稀释浓度为 1：220 的 α-银环蛇毒素和 1：300 的 A-F488 标记的二抗染色，37℃孵育 60min，PBS 洗 5min*3 次。封片，激光 共聚焦显微镜下观察。 2.荧光定量 PCR 法 用 5%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，迅速取出腓肠肌、前 肢肌、咀嚼肌、胸锁乳突肌、眼外肌、肋间肌、膈肌、心肌共 8 组肌群，分别 标记为 A、B、C、D、F、G、H、P 组。用预冷水洗涤 2 次, 在液氮下快速研 磨得到匀浆，每组肌群各称取 60mg 肌肉匀浆。用 Trizoil 一步法从匀浆中提取 总 RNA ,用反转录试剂盒反转录成 cDNA,采用荧光定量 PCR 法检测，PCR 后得 到扩增曲线,设置基线和阈值后,确定 Ct 值。因肌肉中 α1、β1、δ、ε、γ 亚基均有 表达，本实验从中选取 β1 作为研究对象，检测其在成年大鼠不同肌群中的表达 ， 含 量 有 无 差 异 。 查 阅文献得知 β1 亚 基 引 物 序 列 为 ： 上 游 引 物 5 -ATAGCTCAGTAAGGCCGGCG-3， 下游引物 5，- TAGGTGACCTGGATGCTGCA-3,扩增产物长度：355bp；内参 GAPDH 引物序 列为：上游引物 5， -ATGTTCCAGTATGACTCCACTCACG-3， 下游引物 5， -GAAGACACCAGTAGACTCC ACGACA-3，扩增产物长度：170bp 。 结果 1.激光共聚焦显微镜下观察肌肉中乙酰胆碱受体的形态 成束肌纤 维上可看到多个乙酰胆碱受体，集中分布在肌丝中部，呈排状分列。红色 荧光染色区域为乙酰胆碱受体，在肌丝表面可见多个形态相似呈突起状曲 奇饼干样，连续光滑有精细分支的网络状结构，轮廓线均清晰流畅。绿色 荧光染色区域为沿肌丝分布的神经纤维，且绕乙酰胆碱受体周围呈团状分 布。Merge 图可见绿色团状神经纤维轴突与红色乙酰胆碱受体重合呈橙色。 2.qPCR 法检测乙酰胆碱受体 β1 亚基结果 8 组肌群烟碱型乙酰胆碱 II 受体肌肉中 β1 亚基的表达量之间有差异（P〈0.05)。表达量从低到高依次 为眼肌、咀嚼肌、前肢、心肌、膈肌、胸锁乳突肌、肋间肌、腓肠肌，组 间比较腓肠肌、肋间肌、胸锁乳突肌、咀嚼肌、眼肌之间有明显差异（P 〈0.05）。 结论 1.乙酰胆碱受体位于单个肌丝中部，且多个纵行肌丝上受体呈排状分布与 神经纤维和突触囊泡密切结合。 2.大鼠各肌群乙酰胆碱受体基因表达含量从低到高依次为眼肌、咀嚼肌、 胸锁乳突肌、肋间肌、腓肠肌等，与自身免疫性 MG 易受累肌群分布一致。 关键词 神 经 纤 维 神 经 肌 肉 接 头 乙 酰 胆 碱 受 体 重 症 肌 无 力 qPCR III Abst Abstract The research about the AChR content of muscles likely involved in myasthenia gravis Postgraduate: Lisha Su Tutor: Prof.Jinglin Cheng Anesthesiology The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University Zhengzhou Henan 450014 China Abstract Background Neuromuscular junction is the site where the motor nerve terminals and muscle connected to, and it is a kind of synaptic transmission. It is the most studied and understood most clearly. And the entire the signaling essence of nervous system and NMJ