拟南芥AP3基因植物表达载体构建及在烟草中遗传转化.docVIP

拟南芥AP3基因植物表达载体构建及在烟草中遗传转化 　　摘要：拟南芥花器官B类特征基因属于MADS-box基因家族，其中APETALA3（AP3）基因在花瓣和雄蕊中特异性地表达。为探讨AP3基因在花瓣和雄蕊发育中的功能，本研究从拟南芥（Arabidop.sis thaliana）花序中克隆AtAP3基因构建植物表达载体，并转化烟草（Nicotiana tobacum）。通过PCR及qRT-PCR分析，表明AtAP3基因成功转入烟草基因组并表达转录。表型观测显示转基因烟草雄蕊与野生型相比明显变短，说明AP3基因特异性地参与雄蕊的发育并起着至关重要的作用。 　　关键词：拟南芥；APETALA3（AP3）；转基因；烟草；雄蕊发育 　　中图分类号：S188+.1 　　文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）02-0007-05 　　花是被子植物的重要生殖器官。花器官的发育模型最早源于Coen和Meverowitz对拟南芥和金鱼草的研究，并提出了花发育的“ABC”模型，随后该模型被后人逐步发展为“ABCD”或“ABCE”模型。典型的花发育具体可分为四轮，分别为萼片、花瓣、雄蕊和心皮，每一轮的发育都受相应基因的特异性调控。 　　隶属于MADS-box家族的植物花器官B类特征基因在雄蕊及花瓣发育中行使功能。研究表明，B类功能基因在花器官发育时与C类功能基因共同控制雄蕊发育，同时又与A类功能基因共同调控花瓣发育，当B类功能基因缺失，雄蕊会转化为心皮，花瓣则转化为萼片，形成只有心皮和萼片的不完整花器官。B类功能基因在植物进化过程中发生了两次基因重复事件，结果在这个亚家族中产生了四个不同的进化系，分别为DEF/AP3（paleoAP3）、GLO/PI、TM6和euAP3。其中拟南芥经历基因重复后，其B类功能基因产生了属于euAP3进化系成员的APETAIA3（AP3）基因和属于GLO/PI进化系成员的PISTELIATA（PI）基因。 　　目前对花器官发育的研究大多以“ABC”模型为理论基础来丰富其他物种的花器官发育机制，关于拟南芥AP3基因在烟草中异源表达的研究报道较少。本试验根据拟南芥B类功能基因的高度保守性及组织表达特异性，从拟南芥花序中克隆得到AtAP3基因，构建植物表达载体并进行烟草遗传转化。不仅对植物花器官B类特征基因AP3的功能进行了新的补充，还增加了对植物花发育“ABC”模型的新认识。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana Col-0）、野生型烟草（Nicotiana tobacum）种子均为本实验室保存。 　　1.2 菌株及主要试剂 　　大肠杆菌Transl-T1感受态购自Transgen（中国）；农杆菌EHA105由本实验室保存；植物表达载体pROKII质粒，由山东师范大学张慧教授惠赠；质粒提取、胶回收试剂盒购自OMEGA公司（美国）；PCR相关试剂、DNA marker、限制性内切酶、T4 DNA ligase、PrimeScriptrrM RT reagent Kit购自TaKaRa公司（中国大连）；EasyPureTM PlantRNA Kit、pEASY-T1购自Transgen（中国）；其他试剂为进口或国产分析纯。 　　1.3 试验方法 　　1.3.1 拟南芥花序总RNA提取及AtAP3基因的克隆 用EasyPurerM Plant RNA Kit试剂盒提取拟南芥花器官的总RNA，采用PrimeScriptTM RT rea-gent Kit试剂盒进行cDNA合成。以cDNA为模版，利用引物AtAP3-F和AtAP3-R（表1）进行PCR扩增。反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃再延伸7min，PCR结束后全部产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。利用凝胶回收试剂盒回收目的片段，将回收后的片段根据操作手册介绍方法连人pEASY-T1载体中，转化大肠杆菌Transl-T1感受态，涂LB抗性平板（卡那抗性），对获得的单克隆进行菌落PCR验证，筛选后的阳性克隆命名为pEASY-T1-AtAP3，送至哈尔滨博仕生物技术有限公司测序。 　　1.3.2 植物表达载体构建利用限制性内切酶Xba I、Kpn I双酶切重组质粒pEASY-T1-A-tAP3，同时将pROKII载体质粒也用XbaI、Kpn I双酶切，并分别回收目的片段，利用T4 DNA ligase过夜连接转化大肠杆菌Transl-T1感受态，涂LB抗性平板（卡那抗性），对获得的单克隆进行菌落PCR验证，筛选后的阳性克隆命名为pROKII-AtAP3，提取质粒，送至哈尔滨博仕生物技术有限公司测序