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杏花芽石蜡切片方法改良 　　摘要：以杏花芽为材料，在传统石蜡切片方法的基础上，结合杏花芽分化期的结构特点，对软化、透明、浸蜡、染色等重要制片环节进行了一系列的研究。结果显示，将未剥去鳞片的花芽在水中煮沸30min后进行浸蜡，可获得浸蜡彻底、蜡带连续、内部组织完整的石蜡切片，避免了传统制片过程中剥鳞的困难。简化了方法；采用番红一固绿进行片染，不仅染色均匀、图像清晰，而且分色容易、不易造成蜡片脱落和材料组织结构的破坏。是最优的染色方法；通过研究，提出了杏花芽石蜡制片的改良方法。 　　关键词：杏；花芽；石蜡切片 　　中图分类号：S662.2　文献标识码：A　文章编号：1009-9980(2011)03-536-04 　　 　　杏是我国北方的重要栽培果树之一，其果实色泽鲜艳、果肉多汁、风味甜美，深受人们的喜爱。杏树抗寒、抗旱、耐瘠薄、适应性强，具有较高的经济效益和生态效益，但多数杏品种由于雌蕊败育常导致产量低而不稳定。因此，研究杏的花芽分化就显得尤为重要。石蜡切片是细胞组织学和发育生物学研究中常用的一种实验手段，但传统的石蜡制片方法对具有不同组织结构的植物、以及植物不同部位的组织结构并不完全适用，因而需要根据植物的组织结构特点摸索适用的制片方法。杏花芽因外部覆盖着多层角质化的鳞片、蜡质和绒毛，使得制片中的浸蜡和染色较为困难，常造成制片效果不够理想。对于这一问题，前人主要通过剥去芽鳞及外围组织来解决。但我们发现，由于杏花芽较小，鳞片及其外围组织的剥离较为困难，常因造成组织损伤而影响制片效果。我们以杏花芽为实验材料。在传统石蜡切片方法的基础上，结合杏花芽分化期的结构特点，通过对软化、透明、浸蜡、染色等重要制片环节进行研究，建立了适合杏花芽石蜡制片的改良方法，为进一步从解剖学上研究杏花芽的生长机制和微观形态结构提供了新的实验方法。 　　 　　1、材料和方法 　　 　　1.1　材料 　　供试材料采自西北农林科技大学渭河试验站10a生杏品种园，品种为串枝红。采样时，选择新鲜、完整的杏花芽，用锋利的刀片从基部切下后立即投入FAA固定液(70％乙醇90mL+冰醋酸5mL+福尔马林5mL)中固定24h以上。 　　 　　1.2　方法 　　1.2.1　常规杏花芽石蜡制片法　将固定好的花芽剥去鳞片，在爱氏苏木精中染色10－15d，然后在自来水下冲洗12-24h。经70％、85％、90％、95％乙醇逐级梯度脱水(每级50min)后再用无水乙醇脱水2次(每次30min)；将无水乙醇与二甲苯分别按2：1、1：1、1：2比例配成混合液，将脱水后的材料依次放人各混合液中透明20min，再于二甲苯中透明2次，每次15min；透明后的材料在37℃恒温箱浸蜡12-24h，转入56-60℃恒温箱3d，期间更换3-4次纯蜡，包埋；用KDl508轮转式切片机10-12μm切片－黏片－展片；最后用二甲苯脱蜡10min后用中性树胶封片。 　　1.2.2　改良后的石蜡制片法　具体实验流程与常规石蜡制片流程大致相似，但对固定后的材料不做剥去鳞片处理，而是对其进行软化，并对透明、浸蜡、染色过程进行了改良实验。具体过程如下： 　　(1)软化。固定后的材料分别进行以下3种处理：a、将材料用纱布包裹起来浸入水中，加热至沸腾30min；b、将材料浸入乙醇一甘油混合液(1：1)中1―7d；c、材料不做任何处理。 　　(2)透明。脱水后的材料立即放人无水乙醇一二甲苯混合液(1：1)中20min，然后用二甲苯透明2次，每次20min。 　　(3)浸蜡。将透明好的材料放入少量二甲苯中，并少量多次地不断加入石蜡碎屑，直至石蜡不再熔化为止。放置2d(37℃恒温箱中操作)，转入56-60℃恒温箱，每间隔2h换1次纯蜡，共换2次，最后进行包埋及切片。 　　(4)染色。对固定软化后的材料分别进行整体染色(整染)和切片染色(片染)。 　　整染分别采用番红一固绿二重染色和苏木精染色对比进行。a、番红一固绿整染：软化后的材料用番红染色2-3d；脱水(与常规方法相同)；透明与浸蜡按改良后的方法操作；包埋、切片；贴片及展片；切片人二甲苯中脱蜡2次，每次20min，经无水乙醇一二甲苯混合液(1：1)20min后过渡到无水乙醇复水；切片复水至95％乙醇后采用固绿染色30s：无水乙醇脱水2次，每次30s；之后浸入无水乙醇一二甲苯混合液(1：1)中2min，二甲苯中2min后封片。b、爱氏苏木精整染：固定软化后的材料除透明和浸蜡按照改良后的方法进行操作以外，其余步骤都与常规方法相同。 　　片染采用以下3种染色方法对比进行。a、番红一固绿片染：对软化后的材料进行逐级脱水：透明、浸蜡直至脱蜡等环节与番红一固绿整染相同：复水至50％乙醇或蒸馏水后采用50％番红酒精或1％番红水溶液染色4h(37℃