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杏鲍菇原生质体制备条件研究 　　摘 要：通过对酶系、酶解浓度、酶解时间、酶解温度、酶解pH值、稳压剂浓度和杏鲍菇出发菌龄的探索，得出杏鲍菇原生质体制备的条件。其制备条件为：培养5d的菌丝，在0.6mol/L甘露醇配制的2%溶壁酶里，pH 5.5，30℃，50r/min，酶解2.5h，可以获得较高的原生质体产量，产量为6.10×106 个/mL。 　　关键词：杏鲍菇；原生质体；制备条件 　　中图分类号 S646 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）06-15-03 　　杏鲍菇隶属于担子菌亚门、真担子菌纲、层菌亚纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属。杏鲍菇菌肉肥厚，质地脆嫩，营养丰富，是侧耳属中风味较好的一类，有着广阔的市场前景[1-2]。目前食用菌育种方法有野生食用菌驯化育种、孢子分离育种、杂交育种（单倍体交配）、诱变育种、细胞融合育种及转基因育种等方法[3]。食用菌的原生质体全能性较易得到，所以细胞融合育种将为更广泛的使用。研究杏鲍菇原生质体制备的条件，就是为对其进行细胞融合育种创造条件。由于真菌细胞的细胞壁成分较为复杂，不同种甚至同种不同菌株之间的原生质体制备条件也需要进行原生质体制备的条件摸索[4]。根据同类食用菌原生质体制备技术的文献[5-6]，本文对杏鲍菇原生质体的制备条件进行探索。 　　1 材料与方法 　　1.1 菌株 本实验室分离，子实体采自福建省福清市火麒麟食用菌技术开发有限公司。 　　1.2 水解酶 溶壁酶（Lywallzyme），购自广东微生物研究所；纤维素酶（cellulase），购自阿拉丁；蜗牛酶（snailase），购自北京鼎国昌是生物技术有限公司。 　　1.3 方法 　　1.3.1 PDA培养基 将200g马铃薯煮至软烂过滤取汁，加入葡萄糖20g，加水至1 000mL，pH自然。培养基经常规高压灭菌后备用。 　　1.3.2 菌丝体的培养 菌种于PDA培养基上活化培养，从生长良好的菌落边缘用10mm打孔器打取菌丝块，接4块菌饼到铺有玻璃纸的PDA平板培养基上，28℃恒温箱中培养4～7d。 　　1.3.3 酶液的配制 称取一定量的酶溶于0.6mol/L的甘露醇渗透压稳定剂中，调到需要的酶浓度（m/v），用孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤除菌后备用。 　　1.3.4 原生质体的制备 挑取培养好的菌丝置于无菌的10mL离心管中，加入一定量酶液进行酶解，因为菌丝长在玻璃纸上，没有混杂培养基成分，无需洗涤可以直接用于酶解[7]。酶解一定时间后，吸取菌悬液，用血球计数板进行计数，计算原生质体的数量。 　　1.3.5 原生质体制备条件的确定 　　1.3.5.1 酶系的选择 用0.6mol/L甘露醇配置以上酶系，pH4.6，30℃，50r/min的条件下酶解菌丝3.0h，然后显微镜下进行计数，计算原生质体的数量。 　　1.3.5.2 酶浓度的确定 分别用0.6mol/L的甘露醇配置不同浓度的酶液，溶壁酶的浓度（M/V）分别设置为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%。在30℃，pH4.6，50r/min，酶解菌丝3.0h，然后显微镜下进行计数。 　　1.3.5.3 酶解时间的确定 酶解时间设置为1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h和3.5h，在30℃，pH4.6的0.6mol/L甘露醇配制的2.0%酶液，50r/min条件下酶解菌丝，然后显微镜下进行计数。 　　1.3.5.4 酶解pH的确定 酶解环境分别设置了4.0、4.5、5.0、5.5、和6.0等不同的pH值。在30℃，0.6mol/L甘露醇配制的2.0%酶液，50r/min，酶解菌丝2.5h，然后显微镜下进行计数。 　　1.3.5.5 酶解温度的确定 分别设置酶解温度为26℃、28℃、30℃、32℃和34℃，pH5.5，0.6mol/L甘露醇配制的2.0%酶液，50r/min，酶解菌丝2.5h，然后显微镜下进行计数。 　　1.3.5.6 稳压剂浓度的确定 根据参考文献《杏鲍菇原生质体制备与再生条件初探》和《杏鲍菇原生质体制备技术的研究》得出，此菌使用甘露醇作为稳定剂最佳，进而在此设计浓度不同的甘露醇溶液配制的2.0%酶液进行试验，稳压剂浓度分别为0.4M/L、0.5M/L、0.6M/L、0.7M/L和0.8M/L，30℃，pH5.5，酶解菌丝2.5h，然后显微镜下进行计数。 　　1.3.5.7 最佳菌龄的确定 菌丝体在培养3d、4d、5d、6d、和7d后，分别在30℃，pH5.5，0.6mol/L甘露醇配制的2.0%酶液，50r/min的条件下，酶解菌丝2.5h，然后显微镜下进行计数。 　　2 结果与讨论 　　2.1 酶系的选择 蜗牛酶主要作用是降解几丁质，纤维素酶主要是将纤维素分解