来源于西洋梨苹果茎沟病毒分离物基因组分子特性研究.docVIP

来源于西洋梨苹果茎沟病毒分离物基因组分子特性研究 　　摘要：为了获得来源于西洋梨红贝雷沙寄主潜带苹果茎沟病毒（ASGV）分离物的基因组全长序列，并明确其分子特性，采用RT-PCR、RACE末端克隆及生物信息学方法，对ASGV分离物基因组全长进行序列测定，并对其序列特点进行分析。结果发现，来源于西洋梨的ASGV-HB分离物的基因组全长序列为6 496 nt（GenBank登录号：KU605672），含有2个开放阅读框ORF1、ORF2及2个可变区Ⅵ、Ⅶ。序列分析表明ASGV-HB与GenBank登录的18个ASGV分离物的基因组全长核苷酸序列同源性为80.6%～87.7%；ORF1和ORF2编码的氨基酸同源性分别为843%～92.3%和94.4%～98.7%；Ⅵ和Ⅶ可变区的氨基酸序列同源性分别为22.9%～68.8%和48.8%～922%；系统发育树分析显示，来源于不同国家的相同寄主的ASGV分离物聚集为同一分支。结果表明，ASGV的分子变异无地域相关性，具有一定的寄主选择性，研究结果为进一步探究ASGV的群体遗传进化机制及其防治提供了重要的分子信息。 　　关键词：梨；苹果茎沟病毒；基因组全长序列；系统发育树分析；同源性 　　中图分类号： S436.611.1+9 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）18-0043-05 　　收稿日期：2016-05-07 　　基金项目：国家自然科学基金（编号；国家梨产业技术体系（编号：nycytx-29-08）。 　　作者简介：张雪娇（1990―），女，河南周口人，?T士，研究方向为植物分子遗传学。E-mail：yaqifeixue62@。 　　通信作者：崔百明，博士，副教授，研究方向为植物分子遗传学。E-mail：2247237543@。 苹果茎沟病毒（apple stem grooving virus，ASGV）为β-线性病毒科（Flexiviridae）发状病毒属（Capillovirus）的代表种[1]，是一种严重危害果树产业的潜隐性病毒。ASGV感染梨树后一般不产生明显的症状，但对产量和品质有严重的影响，给果树生产带来严重的经济损失。且ASGV一旦感染便较难脱除，脱除率仅为68.9%[2]。ASGV存在多种分子变异，目前尚未报道西洋梨寄主ASGV分离物基因组全长序列信息，了解ASGV的分子序列变异特点为研究ASGV的群体遗传和果树防治提供重要的分子依据。自1965年Waterworth首次报道苹果被感染ASGV后，陆续在梨、杏、柑橘、百合、猕猴桃、樱桃等[3-7]植株上发现该病毒。研究明确ASGV基因组含有2个重叠开放阅读框（open reading frame，ORFs），分别编码多聚蛋白（polyprotein）和运动蛋白（MP），多聚蛋白包含4个结构域，分别为甲基转移酶（Met）、类木瓜蛋白酶（P-Pro）、解旋酶（Hel）、RNA聚合酶（RdRp）和外壳蛋白（CP）[8]；ORF2编码36 ku运动蛋白（MP），与复制酶和CP之间存在重叠[9]。ASGV基因组中存在2个可变区（variable regions），称为Ⅵ和Ⅶ，Ⅴ～Ⅰ可变区在基因组523～570 aa位置处，Ⅶ可变区在复制酶和CP之间，位于1 583～1 868 aa位置处跟ORF2区域存在重叠。Liebenberg等通过对Ⅵ和Ⅶ区进行压力选择分析及系统发育树分析，发现ASGV的多样性与寄主存在一定的相关性[10]。目前GenBank登录了来源于日本百合分离物CTLV-L和CTLV-Li-23，韩国砂梨分离物ASGV-P、德国苹果分离物ASGV-AC和印度日本苹果分离物ASGV-P209及来自中国台湾柑橘分离物CTLV-K和CTLV-LCd-NA-1等18个ASGV分离物的全基因组序列，而国内外尚未报道来源于西洋梨寄主的ASGV分离物基因组全长序列。本研究根据GenBank上登录的ASGV分离物基因组全长序列设计引物，并结合RACE技术首次从西洋梨品种红贝雷沙中获得ASGV分离物，命名为ASGV-HB，分析了其基因组结构并进行生物信息学分析，明确其分子进化地位以及该病毒与地域起源和寄主种类的相关性，旨在为进一步探究果树ASGV的群体遗传和防治提供分子依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　红贝雷沙枝条于2010年4月采自中国农业科学院郑州果树研究所，取枝条韧皮部作为检测材料，采用引物ASGV-U（5′-CCCGCTGTTGGATTTGATACACCTC-3′）/ASGV-2（5′-GGAATTTCACACGACTCCTAACCCTCC-3′）[11]，经 RT-PCR 检测证实感染ASGV；通过芽尖组织培养获得的离体植株保存于华中农业大学“