枯草芽孢杆菌M4诱导猕猴桃抗病相关防御酶系研究.docVIP

枯草芽孢杆菌M4诱导猕猴桃抗病相关防御酶系研究 　　摘要： 采用比色法测定枯草芽孢杆菌M4发酵液不同组分诱导猕猴桃叶片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性变化。结果表明，接种M4发酵液、菌体悬液、上清液、LB培养基，猕猴桃叶片内PAL、POD、PPO、SOD、CAT活性均高于对照无菌水，PAL、PPO、SOD的活性峰值多在接种后8 d出现，POD、CAT的活性峰值多在接种后12 d出现；接种M4发酵液、菌体悬液的PAL、POD、PPO、SOD、CAT活性均明显高于接种上清液、LB培养基，且酶活变化趋势相似，说明M4发酵液中主要有效诱导组分为菌体。 　　关键词： 枯草芽孢杆菌；猕猴桃；多酚氧化酶；苯丙氨酸解氨酶；过氧化氢酶；超氧化物歧化酶；过氧化物酶 　　中图分类号：S436.634 文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）22-0111-03 　　由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa）引起的猕猴桃细菌性溃疡病往往发病严重，流行迅速，防治相当困难。近年来，随着猕猴桃栽培面积的不断增加，细菌性溃疡病快速蔓延，自2005年以来，已在世界主要猕猴桃产区造成严重危害，成为猕猴桃栽培过程中最具毁灭性的病害 。 　　生物防治是控制植物病害、减少化学农药污染的有效途径，而诱导抗性又是植物病害生物防治的重要机理之一[3]，一些微生物可作为植物激活剂，诱导植物产生系统抗性而具有良好的防病效果[4]。植物的抗病性与木质素及相关苯丙烷类代谢物质的积累、病程相关蛋白（PRP）的表达、磷酸戊糖途径、乙醛酸循环等生理过程密切相关[5-6]，参与植物抗病代谢的关键酶有苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）等，其活性变化是反映植物抗病能力强弱较直接和有效的指标之一。 　　近年来研究发现，芽孢杆菌（Bacillus ssp.）是生防菌的优势菌种，诱导植物抗性是其生防作用实现的重要机制之一[7-8]。陕西省科学院酶工程研究所微生物实验室保藏的枯草芽孢杆菌M4对猕猴桃溃疡病具有较好的生防效果，但该菌株是否具有诱导抗性作用，有关其不同组分对猕猴桃抗病相关酶活影响的研究国内外???未见报道。因此，本研究选择PPO、POD、PAL、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）这5种酶作?殁ê锾铱共⌒苑从χ副辏?研究M4菌株发酵液不同组分对猕猴桃叶片内抗病相关防御酶系的影响，以期揭示其诱导抗病性机理，为指导其田间应用提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　枯草芽孢杆菌M4，陕西省科学院酶工程研究所微生物实验室保藏；试验植株为2年生盆栽秦美猕猴桃。LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL，pH值为7.0～7.2。 　　1.2 菌液的制备及接种 　　将菌株M4接种于营养肉汤培养基中，37 ℃、160 r/min振荡培养24 h；将发酵液分成3份，1份保留，另2份合并，4 ℃ 10 000 r/min离心30 min；分别收集菌体和上清液；菌体用无菌水漂洗，再次离心收集，用无菌水稀释成108 CFU/mL的菌液，而上清液用孔径为0.22 μm的细菌过滤器过滤，待温度升至室温，备用。试验设108 CFU/mL发酵液（F-0）、108 CFU/mL 菌体悬液（F-1）、无菌发酵上清液（F-2）3个处理，分别以无菌水、LB培养基处理为对照1（CK1）、对照2（CK2），选取长势一致、健壮的秦美猕猴桃植株，采用叶面喷施接种法进行诱导抗性试验，将菌液均匀喷在猕猴桃叶片上。 　　1.3 PAL、POD、PPO、SOD、CAT活性的测定 　　接种后0、4、8、12、16、20 d分别采样，测定猕猴桃叶片PAL、POD 、PPO、SOD、CAT的活性。PAL提取及活性测定参照薛应龙等的方法[9]进行，以1 g鲜质量D290 nm值变化0.01所需酶量为1个酶活力单位（U）。POD提取及活性测定参照张龙翔等的方法[10]进行，以1 g鲜质量1 min内D470 nm值变化0.01作为1个酶活力单位（U）。PPO提取及活性测定参照朱广廉等的方法[11]进行，以1 g鲜质量1 min内D525 nm值变化0.01为1个酶活力单位（U）。SOD提取及活性测定参照朱广廉等的方法[11]进行，以抑制氮蓝四唑（NBT）还原的50%酶量为1个酶活力单位，以不加酶液而用缓冲液代替酶液的处理为空白对照，酶活计算公式为： 　　N=2×（D560 nm空白-D560 nm处理）/D560 nm空白。 　　CAT提