枯草芽孢杆菌对韭菜迟眼蕈蚊生长发育及代谢活动影响.docVIP

枯草芽孢杆菌对韭菜迟眼蕈蚊生长发育及代谢活动影响 　　摘要：韭菜迟眼蕈蚊幼虫又称韭蛆，是韭菜等多种蔬菜上的主要害虫，化学防治作为其主要的防治方法，造成严重的农药残留问题。为了明确枯草芽孢杆菌对韭菜迟眼蕈蚊的作用，进一步寻找防治韭蛆的新方法，本研究利用枯草芽孢杆菌侵染不同虫态的韭菜迟眼蕈蚊，观察其生长发育情况以及韭蛆体内代谢酶活性的变化。结果表明，枯草芽孢杆菌对韭菜迟眼蕈蚊卵孵化率、蛹羽化率及成虫产卵量均无显著影响，但韭蛆对其反应较为敏感，存活率显著下降。四龄幼虫体内代谢物质检测结果显示，枯草芽孢杆菌侵染后，其体内的海藻糖、蛋白质含量及脂肪酶活性均无显著变化；纤维素酶活性显著提高；几丁质酶、a-淀粉酶、碱性磷酸酶的活性显著或极显著降低，这与韭蛆存活率下降和寿命缩短有一定相关性。因此，枯草芽孢杆菌可以通过调节韭蛆体内部分代谢酶的活性来影响其生长发育，为韭蛆的防治提供新方法。 　　关键词：韭菜迟眼蕈蚊；枯草芽孢杆菌；生长发育；代谢酶活性；防治方法 　　中图分类号：S436.33 　　文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）02-0089-05 　　韭菜迟眼蕈蚊（BradVsia odoriphaga Yang etZhang）属双翅目、长角亚目、眼蕈蚊科、迟眼蕈蚊属。其幼虫又称韭蛆，取食范围十分广泛，可为害百合科、菊科、藜科、十字花科、葫芦科、伞形科等多种蔬菜，尤其是韭菜，致使其产量损失严重。韭蛆危害分布非常广泛，全国各地均有发生，除中国以外，中东、欧洲、北美以及东亚其他地区也有发生。在韭蛆的防治方面，化学防治仍然是目前最有效的方法，但农药的持续使用已经导致农药残留、土壤污染以及抗药性等多种问题的产生，因此，低毒高效的综合防治方法是防治韭蛆危害亟需解决的问题。 　　韭蛆具有钻蛀性，韭菜根部受到危害后易腐烂，同时滋生大量微生物。高欢欢等从韭蛆体内，韭菜鳞茎、根部及其周围土壤中分离出25种微生物，其中枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis在韭蛆和韭菜体内均有发现。枯草芽孢杆菌作为一种肠道微生物已在多种昆虫体内发现，其菌体在生长发育过程中产生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等多种活性物质，对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。a-淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶是昆虫体内物质代谢必不可少的酶；韭菜迟眼蕈蚊以取食韭菜为主，韭菜中纤维素的降解和利用离不开纤维素酶；几丁质酶作为蜕皮和变态过程中的重要酶类，在昆虫的生长发育中发挥着重要作用；碱性磷酸酯酶在生物体中直接参与磷酸基团的转移和代谢过程，是生物体内一种重要的调控酶，对昆虫的防御体系以及滞育时间有调控作用。 　　本研究通过枯草芽孢杆菌侵染，观察韭菜迟眼蕈蚊生长发育的变化规律以及韭蛆体内a-淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、几丁质酶和碱性磷酸酯酶活性的变化，从而明确枯草芽孢杆菌对韭菜迟眼蕈蚊生长发育和代谢活动的影响，为韭蛆的防治提供指导。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　1.1.1 供试虫源 韭菜迟眼蕈蚊幼虫饲养于山东省农业科学院植物保护研究所实验室，温度为（25±1）℃，湿度为（70±5）%，光周期为16L：8D。取不同发育时期（卵、幼虫、蛹和成虫）的韭菜迟眼蕈蚊用于试验。 　　1.1.2 试验仪器与试剂 超净工作台（SW-Cj-ZFD，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；培养箱（RXZ-328A型，宁波江南仪器厂）；离心机（D-78532，德国Tuttlingen）；紫外分光光度计（EMax Plus微孔板读板机，美国美谷分子）；摇床（HY-6A数显调速多用振荡器，常州荣冠实验分析仪器厂）。 　　NB培养基，0.01% PBS缓冲液，2%琼脂，BCA法蛋白含量测定试剂盒、脂肪酶活性试剂盒、海藻糖含量试剂盒、植物a-淀粉酶试剂盒、纤维素酶活性测定试剂盒、组织及血液碱性磷酸酶活性测定试剂盒、几丁质酶试剂盒均购自苏州科铭生物技术有限公司。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 枯草芽孢杆菌活化枯草芽孢杆菌菌株保存于山东省农业科学院植物保护研究所生物防治实验室，在NB培养基上划线培养，重新活化。挑取单菌落过夜摇菌，经稀释和紫外分光光度计测定后，取OD值为1的菌悬液用于试验。 　　1.2.2 韭菜迟眼蕈蚊卵孵化率及韭蛆寿命试验 　　在铺有10mL琼脂和两层滤纸的培养皿中轻轻挑入100枚韭菜迟眼蕈蚊的卵，对照组用无菌PBS溶液浸泡卵30min，处理组用OD值为1的枯草芽孢杆菌悬浮液浸泡卵30min，每组10个重复。取同等大小的韭菜段用75%酒精消毒并用无菌PBS缓冲液冲洗后晾干，处理组经菌液浸泡30s后置于相应培养皿中，对照组以PBS缓冲液浸泡代替。处理后的卵放入培养箱内培养，每天观察卵的孵化情况，孵化后记录韭蛆的死亡数量，用于韭