枯草芽胞杆菌B44菌株培养与发酵优化条件研究.docVIP

枯草芽胞杆菌B44菌株培养与发酵优化条件研究 　　摘要 采用单因素试验和正交试验设计法L16（44）对拮抗细菌――枯草芽孢杆菌B44的液体发酵培养基和发酵条件进行优化试验，确定了在最优培养基Wakimoto’s下，温度为30℃，pH值为7，装液量为90mL，培养24h的条件下其粗提液对小麦全蚀病菌和苹果腐烂病菌的抑制效果最好，抑菌率分别达到70.250 0%和60.510 0%。 　　关键词 枯草芽孢杆菌；培养基；发酵条件 　　中图分类号 S482.2+92文献标识码A文章编号1007-5739（2008）05-0077-02 　　 　　20世纪60年代以来，化学农药引起的环境污染和在农产品中的残留以及病原物产生抗药性等一系列问题日益引起世界各国的广泛关注，寻找对环境友好的无公害、高效的生物农药受到普遍重视[1，2]。生物防治被认为是最具有发展潜力的防治作物病害的方法，并发挥着越来越重要的作用。现在许多学者认为，内生细菌是植物病害生物防治的天然资源菌，具有广阔的理论研究价值和开发应用前景[3，4]，已成为植物学、微生物学、植物保护学及植物育种学等多学科的研究热点问题。国内外使用芽孢杆菌，尤其是枯草芽孢杆菌防治植物病害非常广泛[5]。 　　枯草芽孢杆菌在自然界中广泛存在，对人畜无害，不污染环境，具有显著的抗菌活性和极强的抗逆能力[6，7]，并且许多枯草芽孢杆菌的菌株可以产生对主要植物病原真菌具有抑制活性的代谢产物，是具有极高生物工程利用价值和开发前景的医用抗生素和环保型生物源农药[8]。枯草芽孢杆菌B44菌株是笔者近年从小麦根际土壤中分离出来，并对小麦全蚀病等植物真菌病害具有明显抑制作用的菌株，本研究拟对此菌株的培养优化条件进行研究，为进一步分离提纯活性物质进行仿生合成或大规模的工厂化生产提供科学依据。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1供试材料 　　供试菌株：枯草芽孢杆菌菌株B44、小麦全蚀病菌、苹果腐烂病菌，均由青岛农业大学农业仿生应用工程技术研究中心提供。 　　1.2培养基 　　NA：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，蒸馏水加至1L。 　　BYP：蛋白胨10g，牛肉膏5g，酵母膏5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，蒸馏水加至1L。 　　Wakimoto’s：蛋白胨5g，马铃薯30g，蔗糖15g，硝酸钙0.5g，磷酸二氢钠2.0g，蒸馏水加至1L。 　　LB：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸馏水加至1L。 　　PYG：蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖1g，蒸馏水加至1L。 　　1.3方法 　　1.3.1枯草芽孢杆菌种子发酵液的准备。从试管斜面中挑取1个环枯草芽孢杆菌细菌菌体，接种到NA固体培养基中培养24h，再从NA固体培养基中挑取1个环菌体分别接种于盛有30mL上述5种配方培养基的三角瓶中，在28℃下，经200r/min振荡培养48h，即为枯草芽孢杆菌种子发酵液[8，9]。 　　1.3.2拮抗细菌培养基的选择。选用5种培养基。各培养基的pH值均为7.0，装液量为30mL（250mL三角瓶）。接入1mL相应的种子发酵液，在28℃、200r/min下振荡培养48h。枯草芽孢杆菌细菌培养液在4℃、10 000r/min离心10min去菌体，重复1次，得到上清液即为枯草芽孢杆菌拮抗物质粗提液。用环柱测定法[10]测量小麦全蚀病菌与苹果腐烂病菌在5种培养粗提液下的生长半径的大小，其对照试验用无菌水处理，每个试验重复4次，根据各培养粗提液抑菌率的大小，确定最佳培养基。 　　抑菌率=（对照-处理）/对照×100% 　　1.3.3不同培养条件对拮抗细菌抗菌物质产生的影响。在确定好最佳培养基后，对不同温度、不同pH值、不同通氧量、不同培养时间这些不同培养条件采用L16（44）正交表，4因素4水平安排实验（见表1）[12]，用最佳培养基做种子发酵液（其余同1.3.1），在各培养液中接入1mL种子发酵液，在相应的温度、相应的时间、200r/min下振荡培养之后，拮抗细菌培养液在4℃、10 000r/min离心10min去菌体，重复1次，得到上清液为拮抗物质粗提液。用环柱测定法测量小麦全蚀病菌与苹果腐烂病菌在各培养液粗提液下的生长半径的大小，其对照试验用无菌水处理，每个试验重复4次，根据各培养粗提液抑菌率的大小，确定最佳培养条件。 　　 　　2结果与分析 　　 　　2.1枯草芽孢杆菌B44在不同培养基上的发酵液对小麦全蚀病菌和苹果腐烂病菌的抑制作用 　　研究结果表明（见表2、表3），不同培养基对枯草芽孢杆菌B44抗菌物质的产生有较大的影响。B44菌株在LB、Wakimoto’s、NA、BYP、PYG等5种培养基上的培养粗提液对小麦全蚀病菌的抑制效果分别是20.958