枯草芽孢杆菌S44菌株ituD基因敲除突变株构建.docVIP

枯草芽孢杆菌S44菌株ituD基因敲除突变株构建 　　摘要：利用同源重组基因敲除方法构建了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）S44 ituD基因同源突变株。菌落PCR、RT-PCR、SDS结果均显示ituD基因缺失突变株构建成功。野生株与突变株的菌落形态、生长速率以及抑菌活性均有显著差异。抑菌活性试验结果显示，突变株抑菌活性显著减弱，成功构建的ituD基因突变株为进一步研究ituD基因的生物学功能奠定了基础。 　　关键词：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；ituD基因；敲除突变株；抑菌活性 　　中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）06-1436-04 　　Construction of the ituD Gene Knockout Mutant of Bacillus subtilis S44 　　ZHANG Hui，CHEN Li，ZHAO Si-feng 　　（Key Laboratory of Xinjiang Uygur Autonomous Region for Oasis Agricultural Pest Management and Utilization of Plant Protection Resource/College of Agriculture， Shihezi University， Shihezi 832003， Xinjiang，China） 　　Abstract： To approach the relationship between the ituD gene and the antifungal activity of Bacillus subtilis S44， an isogenic knockout mutant of ituD gene was generated based on the principle of homologous recombination and confirmed by PCR， reverse transcription polymerase chain reaction and SDS. The resulting mutant strain exhibited growth kinetics different from those of the WT parent strain upon cultivation in standard laboratory used in our in vitro assays. The morphology， growth rate and antifungal activity of wild type and mutant colony were significantly different. Antifungal activity results showed antifungal activity mutants were significantly reduced. The ituD mutant was successfully constructed for further study on ituD gene biological function basis. 　　Key words： Bacillus subtilis； ituD gene； knockout mutant； antifungal activity 　　枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）可产生抗菌脂肽、水解酶等多种胞外代谢物，致使植物病原菌菌丝畸形、原生质浓缩、抑制孢子萌发以及菌丝端破裂，这是其防治植物病害的主要机理之一[1，2]。由非核糖体途径合成的脂肽类抗生素是其中最常见的一类，主要包括iturin、surfactin和fengycin 3个家族[3]。iturin家族中的iturin A对多种植物病原真菌有很强的抑菌活性，同时抑菌谱非常广，已被公认为是一种理想的可生物合成的杀菌剂[4]，同时因其抑菌谱广、对哺乳动物低毒和低致敏性，在人和动物药物开发方面也表现出广阔的应用前景[5]。iturin A操纵子由ituD、ituA、ituB和ituC 4个开放阅读框组成，其中ituD基因编码丙二酰CoA转移酶，该基因的缺失将导致iturin A产生的缺乏[6]，通过同源重组构建枯草芽孢杆菌UMAF6639 ituD基因缺失的突变株，发现该突变株没有产生iturin A的能力[7]。本研究中所用枯草芽孢杆菌S44是从新疆维吾尔自治区棉田根际土壤中分离获得，对多种植物病原菌具有很强抑制作用，对棉花黄萎病[8]、棉苗