消痰和中方对慢性胰腺炎大鼠胰腺纤维化形成及相关蛋白表达干预作用.docVIP

消痰和中方对慢性胰腺炎大鼠胰腺纤维化形成及相关蛋白表达干预作用 　　摘要：目的 观察消痰和中方对慢性胰腺炎模型大鼠胰腺纤维化形成及相关蛋白表达的影响，探讨其作用机制。方法 24只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、胰酶组和中药组，每组6只。采用DDC溶液腹腔注射方法造模，其中胰酶组、中药组大鼠分别予胰酶、消痰和中方灌胃，定期测量大鼠体质量。4周后处死大鼠，取胰腺行病理检测及层黏连蛋白、基质金属蛋白酶-1的检测。结果 经DDC溶液腹腔注射的大鼠，胰腺组织中均可见不同程度的纤维化及炎症细胞浸润。中药组大鼠在一般情况、体质量变化、胰腺病理切片评分及层黏连蛋白、基质金属蛋白酶-1表达方面均优于模型组，差异有统计学意义（P0.05）。结论 消痰和中方能有效改善慢性胰腺炎大鼠一般情况，抑制胰腺纤维化形成。其作用机制可能与降低胰腺层黏连蛋白、增强基质金属蛋白酶-1的表达有关。 　　关键词：慢性胰腺炎；消痰和中方；胰腺纤维化；层黏连蛋白；基质金属蛋白酶-1；大鼠 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）10-0032-03 　　目前慢性胰腺炎的病因、发病机制仍不十分清楚，而临床常用的胰酶制剂、胆囊收缩素拮抗剂以及介入手术只能缓解慢性胰腺炎腹痛、腹泻等症状，对严重病例有时甚至只能起到部分缓解的效果[1-4]。而近年来运用中医药防治慢性胰腺炎的研究越来越受到重视[5]。 　　本院魏品康教授根据多年临床经验，从中西医结合的角度认为慢性胰腺炎致病之本在于“痰浊”。慢性胰腺炎多由急性胰腺炎反复发作及其他胰腺病变积累所致，即使急性胰腺炎等疾病治疗后症状缓解，但发病过程中胰腺局部的大量炎症、充血、水肿等，并没有完全消除，容易积聚形成湿浊滞留，反复日久炼化为痰浊，最终导致慢性炎症和纤维化形成。在此认识的基础上，以二陈汤为底方加减建立消痰和中方，从消除痰浊、疏通运化枢机、和降中焦水液代谢的角度治疗慢性胰腺炎。本实验旨在通过动物实验观察消痰和中方对慢性胰腺炎大鼠胰腺纤维化的作用，探讨消痰和中方治疗慢性胰腺炎的潜在作用机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物 　　12周龄雄性Wistar大鼠24只，体质量240～250 g，购自中国科学院动物所，动物许可证号：SCXK（沪）2007-0005，清洁条件下饲养，正常进食进水。 　　1.2 药物与试剂 　　消痰和中方由制天南星、制半夏、鸡内金、茯苓、土鳖虫、炙甘草等药物组成，产地明确，经中国人民解放军第二军医大学药学院生药教研室鉴定，张江生物医药基地制备提供。胰酶肠溶胶囊（得每通）购自荷兰苏威制药有限公司，批号46820。三水合二乙基二硫代氨基甲酸钠（铜试剂， Diethyldithiocarbamate，DDC）购自国药集团化学试剂有限公司，批号乌来糖（氨基甲酸乙酯）购自国药集团化学试剂有限公司，批号伊红染液（HE）购自福州迈新生物技术有限公司。层黏连蛋白（laminin，LN）免疫组化抗体购于英国Abcam公司，批号ab76165。基质金属蛋白酶-1（MMP-1）免疫组化抗体购于美国Abbiotec公司，批号250750。 　　1.3 造模、分组与给药 　　大鼠适应性饲养1周后，按随机数字表法随机分为4组，每组6只。除正常组大鼠每周2次腹腔注射2 mL生理盐水外，其余各组大鼠参照文献[6]方法予500 mg/kg DDC溶液腹腔注射造模，每周2次，共4周。根据临床人的用量，经体表面积换算，胰酶组及中药组大鼠分别予90 mg/kg胰酶、1.5 g/kg消痰和中方灌胃，从造模第1日开始给药，1次/d，共计4周。 　　1.4 一般情况观察 　　分别在造模前（记为第0日）、造模第7、14、21、28日记录大鼠体质量，观察大鼠饮食、饮水、排便、活动等情况。 　　1.5 病理检测 　　4周结束后处死大鼠，以10%中性福尔马林固定胰腺标本，石蜡切片，HE染色行病理检测。高倍镜下观察HE染色后胰腺组织形态学变化。采用文献[6]报道的胰腺组织学评分标准，评价胰腺腺泡细胞萎缩、纤维化形成，炎症细胞浸润。-：无改变；+：病变范围在2～3个小叶内；++：病变范围在一半小叶内；+++：病变范围超过一半小叶。每张切片在低倍镜下随机选取3个视野进行评判。 　　1.6 免疫组化SP法检测胰腺层黏连蛋白、基质金属蛋白酶-1蛋白表达 　　石蜡切片脱蜡和水化后，PBS（pH=7.4）冲洗3次，每次3 min。采用高温高压法进行抗原修复，每张切片加50 μL 3%过氧化氢溶液，室温下孵育10 min，PBS冲洗，甩去PBS液，每张切片加50 ?L的第一抗体（LN、MMP-1兔抗鼠多克隆抗体，稀释度1∶500），4 ℃过夜孵育