脂康对高脂血症家兔血脂及肝脏LDLRmRNA影响研究.docVIP

脂康对高脂血症家兔血脂及肝脏LDLRmRNA影响研究 　　摘要：目的 通过建立新西兰家兔高脂血症模型，探讨肝脏低密度脂蛋白受体(LDL－R)基因水平与高脂血症形成的关系。方法 建立高脂血症家兔模型；观察肝脏的病理改变；应用原位杂交方法检测肝脏低密度脂蛋白受体基因水平。结果 脂康可有效降低血脂水平，井能有效上调肝脏低密度脂蛋白受体基因水平。结论 脂康可激活肝脏细胞膜LDL－R基因表达，使LDL－R的活性增强，有效调节血脂水平，从而延缓改善动脉粥样硬化的形成。 　　关键词：高脂血症；低密度脂蛋白受体；基因表达 　　中图分类号：R285.5　文献标识码：A　文章编号：1672－1349(2007)10－0963－03 　　 　　脂康由黄芪、沙棘、山楂、红花、丹参、三七粉等组成，具有健脾益气、祛痰降浊、活血化瘀之功效，适用于高脂血症及轻中型冠心病，在临床上取得了一定疗效。脂康通过健脾益气，调整阴阳气血和脏腑功能，减少浊脂产生，清除人体内的痰浊、瘀血等有害物质，减少外源性脂质的吸收，抑制脂质合成，促进脂质的转运和清除，影响脂质的肝肠循环，加速脂质排泄等多种途径调节血脂。本实验主要从基因水平研究脂康对高脂血症家兔肝脏低密度脂蛋白受体基因表达的调节作用，从而探讨脂康调节血脂的主要机制。 　　 　　1　材料与方法 　　 　　1．1　脂康方药的制备 本处方由沙棘、山楂、丹参、红花、黄芪、三七等为主组成。经醇提、水提、干燥后制成丸剂，每丸0.5 g，每克含6 g生药。 　　1．2　实验动物造模及用药方法 纯种新西兰大耳白兔60只，体重(1.9～2.1)kg，兔龄4个月，随机选取10只为正常组，喂饲普通颗粒饲料，150 g/d，其余50只给予高脂饲料(1％胆固醇、5％蛋黄粉、5％猪油、89％普通饲料)喂饲，150 g/d。于第4周末根据胆固醇情况随机分为5组，每组10只，模型对照组给予高脂饲料喂饲，150 g/d；其余用药组除给予高脂饲料喂饲150g/d外，脂康低剂量组给予脂康浸膏0.2 g/(kg?d)；脂康高剂量组给予脂康浸膏0.4 g/(kg?d)；血脂康对照组给予血脂康0.18/(ks?d)；辛伐他汀对照组给予辛伐他汀0.8 mg/(kg?d)。家兔用药剂量按人和动物体表面积换算，脂康低剂量或脂康高剂量相当于人60 kR每日的药量。 　　喂饲8周后，麻醉，心脏取血，用于血脂项目检测。取靠近肝门静脉处的肝脏组织，直径约2 cm，用浓度10％甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，用光镜观察。另取肝脏组织，直径约1cm，用浓度4％多聚甲醛固定后做LDL－RmRNA(原位杂交)检测。 　　1．3　生化指标检测 分别于用药前取耳缘静脉血及用药后心脏取血10 mL，离心3000 r/min，10 min，取血清分装，－20℃冰箱保存，血清总胆固醇(TC)和三酰甘油(TG)及高密度脂蛋白胆固醇(HDL－C)含量测定采用酶法，根据Friedward公式法计算低密度脂蛋白胆固醇(LDL－C)，即LDL－C＝TC－(TC/2.2＋HDL－C)。动脉硬化指数(AlP)为TG与HDL－C摩尔浓度比值的对数。血脂检测检测试剂盒：北京中生生物工程高技术公司生产的试剂盒；LDLR ISH原位杂交试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司提供。 　　1．4　肝脏组织LDL－R mRNA原位杂交检测 　　1．4．1　实验步骤　将新鲜的肝组织切成不超过4 mm的小块，并及时用固定液固定1 h。常规脱水、浸蜡、包埋，切片厚度为(6～8)μm。石蜡切片经常规二甲苯、乙醇脱蜡，滴加H2O2室温(5～10)min以灭活内源性酶。暴露mRNA核酸片段：切片上加3％枸橼酸新鲜稀释的胃蛋白酶。37℃，(12～15)min，清洗。固定，胃蛋白酶消化后在玻片上滴加固定液室温固定10 min，清洗3次。预杂交，首先将湿盒准备好，每张切片滴加20 μL预杂交液，放人湿盒内，(38～42)℃4 h，甩去多余的液体。杂交：在每张玻片上滴加20μL杂交液，将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。放恒温箱杂交过夜。杂交后洗涤。滴加封闭液：放入37℃30 min后取出，甩去多余液体，不洗。滴加生物素化鼠抗地高辛，放入37℃60 min，PBS洗涤。滴加SABC；放入37℃30 min，PBS洗涤。滴加生物素化过氧化物酶，37℃恒温箱中放置30min，PBS洗涤。DAB显色，使用DAB显色试剂盒，滴至玻片上，显色(30～50)min，充分水洗，苏木精复染，充分水洗，酒精脱水，二甲苯透明，封固。 　　1．4．2　原位杂交实验结果判定 光学显微镜下观察结果的判定标准：原位杂交结果以细胞浆内或核膜上出现棕黄色颗粒者或斑片为阳性细胞。 　　1．4．3　分析方法 计算机图像分析，在图像卡