脂联素对高糖环境下人心肌细胞凋亡及BaxBcl2表达影响.docVIP

脂联素对高糖环境下人心肌细胞凋亡及BaxBcl2表达影响 　　 摘要：目的 探讨脂联素（ADPN）对高糖环境下人心肌细胞株（HCM）的凋亡及凋亡因子Bax、Bcl-2表达的影响，揭示脂联素对高糖环境中心肌细胞可能的保护机制。方法 将培养的HCM随机分为正常对照组、高糖组、高糖+脂联素组，分别培养24 h、48 h、72 h，运用MTT法测定不同时间段细胞增殖情况；流式细胞术测定细胞凋亡率；实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术测定细胞Bax/Bcl-2表达情况。结果 与对照组相比，高糖持续作用抑制细胞增殖，增加细胞凋亡率，并使Bax表达上调，而Bcl-2表达下降。脂联素组细胞增殖明显增加，并通过下调Bax和上调Bcl-2抑制细胞凋亡，且该作用呈时间依赖性，与高糖组相比差异有统计学意义（P0.05）。结论 脂联素可以抑制心肌细胞凋亡，对高糖作用下的心肌细胞具有保护作用。 　　 关键词：脂联素；人心肌细胞；Bax/Bcl-2；糖尿病；心肌病 　　 中图分类号：R329.3 R587.1 文献标识码：B 文章编号：1672-1349（2012）01-0037-03 　　 　　 近年多项研究表明，在众多脂肪细胞分泌的蛋白和代谢物中，脂联素（ADPN）是唯一提高胰岛素敏感性、对心血管具有保护作用因子。本研究旨在探讨脂联素对高糖环境下心肌细胞凋亡的影响，以揭示脂联素对糖尿病心肌病（DCM）中心肌细胞的可能保护机制，为防治糖尿病心肌病提供新的思路。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 人心肌细胞株（HCM）购于美国SinceCell公司上海代购，DMEM培养基（美国HyClone公司），胰蛋白酶（北京Solarbio公司），胎牛血清（美国HyClone公司），D-葡萄糖（北京Solarbio公司），MTT试剂盒（美国Sigma公司），脂联素(Human gAcrp 美国Pepro Tech公司)，Trizol试剂（上海生工生物工程有限公司），FastStart Universal SYRB Green Master(ROX，美国Roche公司）。Bax引物，上游：5′-TTTGCTTCAGGGTTTCATCC-3′；下游：5′-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3′。Bcl-2引物，上游：5′-GGATGCCTTTGTGGAACTGT-3′；下游：5′-AGCCTGCAGCTTTGTTTCAT-3′。β-actin引物，上游：5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′；下游：5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′184bp（ 上海生工生物工程有限公司）。 　　1.2 人心肌细胞的培养及分组 HCM培养于含10%胎牛血清，5.5 mmol/L D-葡萄糖，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中，并置于37 ℃含5%的CO?2的孵箱中孵育，细胞生长至约85%融合时，用0.25%的胰蛋白酶消化传代。正常对照组D-葡萄糖浓度5.5 mmol/L;高糖组D-葡萄糖浓度30.0 mmol/L；高糖加脂联素组D-葡萄糖浓度30.0 mmol/L+ADPN 2.5 μg/mL。 　　1.3 实验方法 　　1.3.1 MTT法 取部分生长状态佳的细胞，以1×10?4个/mL接种至96孔板，待细胞贴壁后，改用无血清培养基培养6 h。按照实验分组进行干预，每组设3个复孔，同时设凋零孔，分别培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入MTT 20 μL，孵育4 h后，每孔加入DMSO150 μL，振荡10 min，待DMSO溶解后，于酶标仪490 nm处测得吸光度OD值。 　　1.3.2 流式细胞术 取部分生长状态佳的细胞，以1×10?5个/mL接种至6孔板，待细胞贴壁后，改用无血清培养基培养6 h，使细胞同步化，弃去培养液，按照实验分组进行干预，每组设3个复孔，分别培养24 h、48 h、72 h，用脂结合蛋白AnnexinV/碘化丙啶（PI）双染色标记后，流式细胞仪测细胞的凋亡百分率。结果判断，正常活细胞AnnexinV/PI均低染；凋亡细胞AnnexinV高染，PI低染；坏死细胞AnnexinV/PI均高染。 　　1.3.3 荧光定量PCR 总RNA的提取,细胞生长至约80%融合时，弃去培养基，加入无血清培养基6 h后，按实验分组进行干预，弃去上清，加入Trizol试剂提取总RNA。将RNA反转录为cDNA。 目的基因Bax引物，上游：5′-TTTGCTTCAGGGTTTCATCC-3′；下游：5′-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3′。Bcl-2引物，上游：5′-GGATGCCTTTGTGGAACTGT-3′；下游：5′-AGCCTGCAGCTTTGTTTCA