锦鲤疱疹病毒―CJ株ORF108基因克隆及生物信息学分析.docVIP

锦鲤疱疹病毒―CJ株ORF108基因克隆及生物信息学分析 　　摘要：为研究我国锦鲤疱疹病毒的基因背景信息，从锦鲤疱疹病毒中国吉林株（KHV-CJ株）获得ORF108基因，应用生物信息学方法分析KHV-CJ株ORF108基因结构和功能。结果显示，ORF108基因长588bp，为一完整的开放阅读框，编码196个氨基酸，理论分子质量为21207.37Da。KHV-CJ株与美国株（KHV-U）的ORF108基因的序列一致性为99%，在第564位的碱基A突变为G。但该突变位置编码的氨基酸并没有发生改变，同为丝氨酸。ORF108基因编码蛋白的1-61位氨基酸位于细胞膜表面，62-84位氨基酸之间形成一个典型的跨膜螺旋区。该蛋白的表面抗原决定簇位点区域广泛、峰值高，预示该基因可作为基因工程疫苗的重要候选基因。 　　关键词：锦鲤疱疹病毒;ORF108基因;生物信息学分析 　　基金项目：长春市科学技术局先进实用技术的示范推广项目（12XN35） 　　中图分类号： S941.41 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/ki.jlny.2015.22.043 　　自从20世纪90年代末，锦鲤疱疹病毒病（Kioherpesvirusdisease，KHVD）就在普通鲤鱼和观赏锦鲤上发现并报道[1-2]。感染本病毒后病鱼聚集在进水口，身体出现白色斑块，皮肤呈现砂纸状纹理并变得粗糙。病鱼出现鳃和眼睛凹陷坏死等症状。 　　引起本病的病原较早称锦鲤疱疹病毒（Kio herpesvirus，KHV）。有人根据其病理变化又称为鲤肾炎鳃坏死病毒。2012年ICTV（国际病毒命名委员会）发布的第九次分类报告将本病毒命名为鲤疱疹病毒3型（Cyprinid herpesvirus 3，CyHV-3）。本病毒隶属于疱疹病毒目（Herpesvirales）异样疱疹病毒科（Alloherpesviridae）鲤疱疹病毒属（Cyprinivirus）成员。相关文献一般仍沿用锦鲤疱疹病毒这个名字。 　　鲤疱疹病毒属内还有鲤疱疹病毒Ⅰ型和鲤疱疹病毒Ⅱ型两种病毒。锦鲤疱疹病毒具有双链DNA基因组，是鱼类疱疹病毒属中基因组最大的病毒[3]，长达295kbp，有156个开放阅读框[4]。基因装在20面立体结构的核衣壳内，外面包裹来源于宿主的囊膜，囊膜上镶嵌病毒表达的糖蛋白。截至目前，病毒的基因有40个结构蛋白被鉴定。包括3个衣壳蛋白，13个囊膜蛋白，2个被膜蛋白以及22个未分类蛋白[5]。 　　感染本病毒初期鱼体内各组织均有病毒分布，然后病毒在几个组织和外周白细胞中持续感染，使得普通鲤鱼和锦鲤造成潜伏性感染[6]。当鱼在装载、运输等环境压力下，潜伏的病毒能被激活重新复制进入到细胞外面去，造成排毒并发病[7-8]。因此频繁的异地运输和贸易使得本病快速的传播[9]。锦鲤疱疹病毒病无论在人工养殖的普通鲤鱼和锦鲤中还是在自然水域中都普遍存在。本病死亡率最高可达100%，严重影响观赏锦鲤的全球贸易和鲤鱼养殖。鉴于锦鲤疱疹病毒病的严重性，联合国粮食及农业组织和世界动物卫生组织都将其列入到了水产养殖和食品资源安全威胁列表和必须呈报的疾病名单中[10]。 　　鲤鱼针对锦鲤疱疹病毒的免疫应答包括先天性免疫和适应性免疫。致病结果很大程度上应答是有利于病毒所采用的逃避策略还是宿主的免疫应答，理解这两个相反的过程可以帮助开发疫苗或治疗，采用合适的手段来控制本病。 　　锦鲤疱疹病毒病死亡率高，除预防接种外尚无有效的治疗方法[11]。对于病毒与机体的相互作用，机体对本病毒的应答机理也未明确。Michael Gotesman等针对TK基因和DNA聚合酶基因（TP）设计siRNA片段在体外进行实验，结果能有效减少病毒颗粒从CCB的释放[12]。 　　本研究以锦鲤疱疹病毒吉林株（KHV-CJ株）基因组为模板，利用PCR技术获得KHV膜蛋白ORF108基因，分析基因的生物学信息，目的是为我国锦鲤疱疹病毒的基因背景信息、分子流行病学及基因工程疫苗的研究奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 毒株与试剂 　　KHV吉林株及锦鲤尾鳍原代细胞（KF-1）由本实验室保存[13]。 　　新生牛血清、L-15培养基;ExTaqDNA聚合酶、限制性内切酶EcoRⅤ和EcoRⅠ、10×ExBuffer、dNTPMix、DNAMarker、DNA胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒。 　　1.2 引物的设计及合成 　　依据GenBank上登录的KHV全基因组序列（GenBank：DQ657948.1）的ORF108基因序列，利用引物设计软件Primer Premiers 5.0设计引物如下： 　　OR