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浅谈分子生物学在土壤微生物多样性研究中应用 　　摘要：传统的土壤微生物分离培养、鉴定技术难以深入了解微生物的生态学特性和多样性，而分子生物学方法可以获取更加丰富的土壤微生物群落多样性信息，包括?魍撤椒ㄎ薹ㄅ嘌?的土壤微生物。本文就目前土壤微生物的多样性研究中使用的分子生物学技术进行探讨研究，并对各个分子生物学实验技术的特点做了比较分析。 　　关键词：土壤微生物；生物多样性；分子生物学；DNA 　　一、土壤微生物多样性的定义 　　土壤微生物的多样性体现在生物体在遗传、种类和生态系统层次上的差异和变化，也反映了土壤生态机制对微生物群落的影响。土壤微生物多样性还可以理解为丰富的微生物生命。一般由土壤生物区的变化和生物化学过程间的关系来体现。 　　二、土壤微生物多样性研究中运用的分子生物学技术 　　（一）土壤微生物DNA复性动力学分析 　　实验表明，可以通过测定微生物群落DNA的复性率和解链行为来确定土壤微生物群落的大体成分和整体遗传多样性。微生物多样性的复杂程度随着DNA的同源性变化，DNA同源性越差，多样性越复杂，DNA的复性率就越低。在受不同程度重金属污染的土壤中微生物多样性的变化中这种方法被Sandaa等所采用。没有受到污染的对照土壤通过该技术分析显示含有32 000个细菌基因组，而这个数字在受重金属污染程度较轻的土壤是1 2800，在受严重重金属污染的土壤是4000个，相比未受污染的土壤中的细菌基因组分别减少了60%和90%。由数据可知，土壤受到污染越严重，土壤微生物多样性越低。但这个技术有明显的缺点，即分辨率不高，仅仅用这个技术来分析只能知道土壤微生物群落的大体情况，并不能精确表示微生物多样性的变化情况。因此在实际研究中，还需要结合核酸杂交等更好的技术才能得到更精确的结果。 　　（二）核酸分子杂交技术 　　20世纪70年代出现了分子生物学技术――核酸分子杂交技术。这种技术的原理是根据核酸分子碱基互补配对的原则，将待测微生物的DNA或RNA与特异性探针进行杂交形成新的分子。核酸分子杂交技术由于其特异性灵敏性高的优点，在近年的微生物多样性研究中被广泛应用。其中最为常用的的手段是近年来发展起来的荧光原位杂交技术。它可以鉴定细胞形态和微生物种群结构，进行样品的原位杂交，也可用于测定细胞活性和计数。该技术根据已知微生物的不同类别种群特殊的DNS序列用荧光标记的特殊寡聚核苷酸片段作为探针，与待测微生物的DN分子杂交，以测定该微生物群落多样性的丰度。研究结果也显示，土壤微生物的多样性随土壤受污染程度的升高而下降，但是荧光原位杂交技术（FISH）对于土壤样品的灵敏度较低。 　　（三）基于PCR的分子生物学研究技术 　　PCR技术的出现和运用使土壤微生物生态学研究获得飞跃发展。由于土壤微生物群落的16S rRNA、18S rDNA 或ITS 区域目标基因含有高度保守序列、多拷贝序列和高度可变序列，因而其基因结构相对稳定，利于设计特异性引物，现已成为细菌分类学研究中最常用最有效的分子钟。此外，真菌ITS的分析也越来越受到重视，因为其序列中包含保守和可变信息。可以借助用特异性或通用引物在直接提取和纯化土壤微生物样品的总DNA后扩增目标片段，然后分期目标片段。基于PCR的分子生物学技术有以下几种。 　　1. 变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳（DGGE/TGGE）。该技术的原理是对DNS双链分子使用化学变性剂或温度对其进行处理，以分离序列不同但长度相同的DNA片段。可以根据条带的位置和电泳条带的数量大致确定土壤中的微生物种类，对土壤中的微生物的多样性进行粗略分析。此方法有很高的灵敏度，通过成像系统分析染色后的凝胶，切下目标带进行扩增或测序可以获取更完整的信息。除此之外DGGE/TGGE技术因为能同时测定多个土壤样品的微生物群落构成和变化情况，具有可重复性、快速等特点，所以被广泛应用在土壤微生物的多样性研究等方面。其缺点是，目前还不能检测到所有的微生物多样性，特变是难以检测到劣势微生物种群。 　　2.单链构象多态性（SSCP）。SSCP方法的原理是，单链DNA的构象会随着碱基的变化而变化，而具有不同空间构象的单链DNA分子在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的带型也不同，以此精确地区分二级结构不同但大小一样的PCR产物。在研究高温堆肥微生物群落、根系微生物、受污染的土壤微生物生态多样性方面SSCP方法已经被成功应用。比如通过该方法分析根系微生物，已准确地检测到微生物群落的动态变化，SSCP方法比传统培养更加省时省力，避免了误差大的干扰，在对微生物群落结构和演替的分析中非常适用。 　　3.限制性片段长度多态性（RFLP）/扩增核糖体DNA限制性分析（ARDRA）。限制性片段长度多态性（RFLP）另一个名称是扩增核糖体DNA限制性