黄芩素对阿尔茨海默病大鼠早期脑组织蛋白表达谱影响.docVIP

黄芩素对阿尔茨海默病大鼠早期脑组织蛋白表达谱影响 　　摘要：目的 观察黄芩素对阿尔茨海默病（AD）大鼠发病早期认知功能和皮层、海马组织蛋白表达谱的影响，探讨其作用机制。方法 实验大鼠随机分为对照组、模型组、黄芩素组，每组12只。黄芩素组大鼠予黄芩素药液灌胃，模型组和对照组大鼠予等量生理盐水灌胃。灌胃体积均为2 mL，连续10 d。利用Morris水迷宫评估治疗效果，并运用双向凝胶电泳技术对脑组织蛋白进行分离，考马斯蓝染显色，应用PDQuest8.0软件对双向电泳图谱进行差异分析，通过MALDI-TOF-MS/MS和数据库查询鉴定差异明显的蛋白质点，并利用String在线分析软件对差异表达蛋白进行生物信息学分析。结果 黄芩素可显著缓解β-淀粉样蛋白（Aβ）1-40导致的认知功能减退。黄芩素作用下，位于大鼠大脑皮层和海马组织的8种蛋白表达水平变化明显。质谱鉴定结果显示，差异蛋白涉及4种生物学功能，与神经传导关系最为密切，其中3种蛋白与其他蛋白存在相互作用关系。结论 黄芩素对AD大鼠早期认知功能损伤的改善作用与其能够调节神经传导相关蛋白的表达相关。 　　关键词：阿尔茨海默病；β-淀粉样蛋白；黄芩素；神经传导；蛋白组学；学习记忆；大鼠 　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.016 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）08-0059-05 　　阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种危害老年人健康、影响老年人生活质量的神经退行性疾病。自20世纪90年代起我国步入老龄化社会，AD发病率逐年增高[1]。其主要临床表现为记忆下降与认知功能障碍，病理学表现有脑细胞外β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉积形成的神经炎性斑（neuritic plaques，NP）与脑细胞内高度磷酸化的tau蛋白形成神经元纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）[2]。目前，由于AD病因不明，现有西药只能缓解症状而不能针对病因进行治疗，新药的研发又处于瓶颈期难以突破。药用植物学逐渐成为近年来的研究热点。因此，从传统中草药中寻找对AD有疗效的活性单体是一项具有广阔前景与实际意义的工作。黄芩（Radix Scutellariae）为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。《神农本草经》载黄芩有“诸热黄胆，肠泄痢，逐水，下血闭，恶疮疽蚀火疡”功效。现代药理研究表明，黄芩不仅有传统的抗菌、抗炎等功效，还可作用于神经系统。黄芩水提物对脑出血大鼠血脑屏障损伤有一定的治疗和保护作用[3]。黄芩中具有生物活性的黄酮类物质黄芩素可通过抗细胞凋亡、抗氧化等机制起到神经保护作用[4]。本实验旨在利用蛋白组学技术对比黄芩素治疗前后AD模型大鼠脑组织皮层及海马组织蛋白表达谱的差异，利用双向凝胶电泳（2-DE）、MALDI-TOF-MS/MS、数据库查询和生物信息学分析技术研究由Aβ1-40和黄芩素治疗所导致的大鼠大脑皮层和海马的差异蛋白，从亚细胞蛋白水平寻找证据，为黄芩素作为治疗AD的临床药物提供更充分的实验依据。 　　1 实验材料 　　1.1 药物 　　黄芩素，瑞士Fluka Bio Chemika公司，溶于生理盐水，用NaOH溶液将pH值调至10。 　　1.2 动物 　　雄性SPF级SD大鼠36只，4月龄，体质量250～300 g，北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（京）2009-0015。饲养于北京中医药大学东方医院实验中心SPF级动物实验室，温度（22±2）℃，相对湿度（55±5）%，人工光照时间为明暗各12 h。 　　1.3 主要试剂与仪器 　　Aβ1-40，美国Sigma-Aldrich公司，实验前将其用无菌生理盐水稀释至10 mg/mL，4 ℃孵育48 h至Aβ1-40多聚体，4 ℃冰箱保存备用。0.25%TrypsinEDTA（美国Gibco公司），六氟异丙醇[阿拉丁试剂（中国）有限公司]；二甲基亚砜（DMSO，北京索莱宝科技有限公司）。IPG缓冲液、蛋白酶抑制剂，美国Sigma公司；Morris水迷宫DMS-3，中国医学科学院药物所；CLASS100型超净工作台，珠海造鑫企业有限公司；MilliQ超纯水系统，Millipore公司；IX71型倒置荧光相差显微镜、BX-60型倒置荧光相差显微镜数码相机，日本Olympus公司；JY92-2D超声波细胞破碎机，宁波新芝公司；ELX80酶标仪，美国Bio-Tek公司；1/1000A2005型精密电子天平，德国Saitorius公司；5415D型低温高速多功能离心机，德国Eppendo