黄连生物碱对体外培养小鼠腹腔巨噬细胞影响.docVIP

黄连生物碱对体外培养小鼠腹腔巨噬细胞影响 　　[摘要] 该文主要研究4种黄连生物碱对小鼠腹腔巨噬细胞的影响，初步探讨其调节机制。MTT法检测黄连生物碱对巨噬细胞活力的影响；采用中性红实验和NBT法分别测定生物碱对巨噬细胞吞噬和呼吸爆发活性的影响；通过实时荧光定量PCR检测黄连生物碱处理后巨噬细胞呼吸爆发相关基因的表达量；用荧光分光光度计检测生物碱对巨噬细胞膜蛋白构象的影响。结果显示，4种黄连生物碱对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能都有不同程度的提高，小檗碱效果最好；小檗碱、黄连碱和巴马汀对佛波酯（PMA）刺激的小鼠腹腔巨噬细胞呼吸爆发活性具有正向调节的作用，并且能够在一定程度上增加巨噬细胞中PKC，p40phox或p47phox mRNA的表达量，而表小檗碱对呼吸爆发没有显著性影响；黄连生物碱能够改变巨噬细胞膜蛋白的构象，其中小檗碱作用最强。结果表明黄连生物碱可能通过改变巨噬细胞膜蛋白构象从而激活巨噬细胞，增强其吞噬和呼吸爆发功能，而且，生物碱对巨噬细胞呼吸爆发的调节机制还可能与相关基因PKC，p40phox和p47phox mRNA的表达有关。 　　[关键词] 黄连；生物碱；巨噬细胞；吞噬；呼吸爆发 　　黄连为毛莨科植物黄连Coptis chinesis Franch、三角叶黄连C. deltoidea C. Y. Cheng et Hisao或云连C. teeta Wall的干燥根茎，其作为常用中药，具有清热燥湿、泻火解毒的功效[1]。生物碱是黄连的主要活性成分，主要包括小檗碱、黄连碱、巴马汀和表小檗碱等。黄连具有抗菌[2]、降糖[3]、保肝[45]、镇痛[6]、抗肿瘤[7]、抗炎[8]等药效。另外，有研究报道小檗碱可以增强小鼠的非特异性免疫反应，增强腹腔巨噬细胞吞噬白葡萄球菌的功能[9]。黄连生物碱的结构类似，具有相似的药理活性，但对黄连其他生物碱的免疫作用及比较鲜有报道。 　　巨噬细胞是固有免疫系统的重要组成部分，具有强大的免疫功能，活化的巨噬细胞具有很强的吞噬功能[10]。巨噬细胞被激活或者受到刺激后，在吞噬过程中或之后发生呼吸爆发，表现为巨噬细胞爆发性地增加氧的消耗。另外，呼吸爆发是吞噬细胞（包括多形核的白细胞和巨噬细胞等）杀灭病原体的重要途径之一，是吞噬细胞功能的反映[11]。NADPH氧化酶是呼吸爆发过程的关键酶，p40phox，p47phox以及p67phox是NADPH氧化酶的3个细胞质亚单位。另外，PKC能够直接激活NADPH氧化酶进而触发呼吸爆发[12]。本实验选择离体的小鼠腹腔巨噬细胞为对象，研究黄连生物碱对巨噬细胞吞噬和呼吸爆发功能的影响，并对其作用机制进行了初步的探究。 　　1材料 　　1.1药物与试剂 小檗碱，巴马汀，黄连碱，表小檗碱（纯度95%）由本实验室提供；RNA提取试剂盒（Invitrogen 公司，批号 14105）；反转录试剂盒（宝生物工程大连有限公司，批号 AK4302）；实时荧光定量PCR试剂盒（宝生物工程大连有限公司，批号 AK4003）；MTT（Sigma公司）；中性红和NBT（Genview公司）；佛波酯（PMA，Sigma公司）；台盼蓝及细胞培养相关耗材购自北京鼎国生物技术有限公司。 　　1.2动物 SPF级昆明种小鼠，雌性，体重（25±2） g，购于重庆市中药研究院实验动物研究中心，生产许可证号 SCXK（渝购买后在以下条件下平衡1周：温度（20±2） ℃，湿度（55±15）%。 　　1.3仪器 Auanti J30I高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特公司）；CO2培养箱（美国Thermo公司）；倒置生物显微镜（重庆奥特光学仪器有限责任公司）；ELX808酶标仪（BioTek Instruments 基因有限公司）；NanoDrop2000c型超微量核酸蛋白测定仪（Thermo公司）；荧光定量PCR仪（BioRAD公司）；日立F4500型荧光分光光度计（日本Hitachi公司）。 　　2方法 　　2.1小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养[13] 将小鼠摘眼球放血，脱臼处死。先放入碘伏中3 min，再放入75%乙醇中3 min。腹腔注入5 mL预冷的RPMI1640培养基，至腹腔液为淡黄色，抽出转移至无菌离心管中，重复以上操作2次。将细胞悬液1 000×g离心10 min，弃去上清液收集巨噬细胞。台盼蓝染色计数活细胞，当活细胞数达到95%以上时调整细胞浓度并接种于96孔细胞培养板中，置37 ℃，5%CO2的培养箱中培养，2 h后用PBS洗去未贴壁的细胞，即得纯化的小鼠腹腔巨噬细胞。 　　2.24种生物碱对巨噬细胞活力的影响 取已在96孔板中贴壁纯化的巨噬细胞，加入培养基和黄连生物碱（生物碱的终浓度分别为0，0.04，0.2，1，5，25，50