质粒重组课件.ppt

限制性内切酶在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类似的序列。 星号活性的识别形式常对标准识别顺序中两侧的碱基没有特异性。因此, 尽量采用规范的实验步骤, 应用推荐的反应条件。 星号活力 克隆（有时与甲基化酶联用） 鉴定（基因片断大小、正反向） 检测突变（识别位点，限制酶切图谱的多态性RFLP） 制作Marker 限制性内切酶的应用 限制性内切酶的使用 一个标准的酶切反应包含： DNA 合适的酶缓冲液 蛋白酶 为了提高酶切效率，可加入BSA。 1、建立一个标准的酶切反应 通常，10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X Buffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。 一般说来，线性DNA比超螺旋DNA更易消化。比如，酶切1ug lambdaDNA，需要1-2单位的酶，而酶切1ug质粒DNA，需要3-5单位的酶。 应用中的注意点 2. 选择正确的酶 不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。内切酶的产物可以是粘端的（3或5突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接 3、加酶 内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。 4、DNA 待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素 5、缓冲液 对于每一种酶都提供相应的最佳缓冲液，可保证酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响 6、 反应体积 内切酶活力单位的定义是：1小时内，50μl反应体积中，降解1μg的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶：DNA的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%（一般酶都贮存于50%的甘油中） 7、混合 这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡！ 8、反应温度 大部分酶的反应温度为37℃；从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。一般为50-65℃不等 9、反应时间 1酶活单位的定义时间为1小时。如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间；反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全 λ噬菌体(λphage) 特点：一种能感染大肠杆菌的病毒，野生型为双链线状DNA分子，长度48.5kb, 分子两端各有一个12bp组成的粘性末端, 感染大肠杆菌后,线状DNA通过粘性末端互补连接成环, 连接处称COS位点。 1. 本身有复制体系; 2. 中间(J-N间) 是λ生长非必需区, 可被其它外源DNA取代; 3. λDNA在体外可包装成病毒颗粒, 感染效率高; 4. 载体容量大,可装入大片段外源DNA (20kb); 5. 可人工加入多克隆位点; 6. 筛选容易——噬菌斑筛选; 7. 主要用于DNA文库构建. 插入型载体——含单一的限制性酶切位点，可接受10kb以下的外源片段，可用于cDNA文库构建； 取代型载体——含某一限制性酶的两个切点，可接受20kb左右的外源片段，可用于基因组DNA文库构建。 粘性质粒(cosmid) 是一种人工改造的载体,双链环状DNA， 含有λDNA的 cos区+质粒，克隆容量：40 ~ 50kb  1. λ-DNA的COS位点; 2. 质粒的复制起点和抗药性标记 (Ampr); 3. 多种单一的酶切位点. cosmid较小, 约4 – 6kb, 可容纳40-45kb的外源DNA,由于?噬菌体DNA包装时包装蛋白识别的只是?DNA 粘性末端附近的一小段顺序，因此只要一个质粒接上此粘性末端顺序，再加上外源DNA片段使其长度为野生型?DNA大小的75－105%，重组体可象噬菌体一样进行外壳装配, 形成噬菌体颗粒, 感染大肠杆菌效率比质粒高得多, 进入宿主细胞后, 只能象质粒一样扩增, 并