茶树花青素还原酶基因的原核表达-生理学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE iv iii iii 摘要 儿茶素是茶树重要次生代谢产物茶多酚的主体组分，也是决定茶叶品质的主要化 学成分，研究茶儿茶素合成途径中关键基因的功能，对茶树良种选育、茶叶品质调控 具有重要意义。 儿茶素合成途径基本探明，其中花青素还原酶（ANR）是儿茶素EC和EGC合成 直接相关的酶类，本实验利用RT-PCR、原核表达、HPLC技术，对GeneBank登录的 两条茶树ANR基因进行了克隆、目的蛋白的原核表达、蛋白酶活性检测、反应产物鉴 定等；并对目的蛋白在原核表达中的诱导时间、诱导温度、诱导剂IPTG浓度、氨苄 青霉素浓度进行了优化。 主要研究结果如下： 1.通过RT-PCR技术克隆了CsANR1和CsANR2的ORF序列，使用DNAMAN软件、 SignalP3.0软件、SOPMA软件、SWISS-MODEL网站软件，对两个基因的序列进行了 比对，预测了信号肽序列，模拟了蛋白质的二级和三级结构。结果显示：CsANR1 和CsANR2两个基因的氨基酸序列一致性为79%；CsANR1其N段34个氨基酸为信号肽 序列，CsANR2其N端44个氨基酸为信号肽序列，去除信号肽之后两个基因的氨基酸 序列一致性为83%；CsANR1和CsANR2蛋白质二级结构元件数量和分布非常相似， 模拟的三级结构也非常相似。蛋白质空间结构推测CsANR1和CsANR2具有相似的功 能，但信号肽差异推测两种蛋白的亚细胞定位有差异。 2. 利用构建的 pET-ANR1 和 pET-ANR2 重组质粒，转化了表达宿主菌 rosetta(DE3)，并用IPTG诱导目的蛋白表达，通过对诱导时间、诱导温度、诱导IPTG 浓度、氨苄青霉素浓度进行优化，确立以25℃为诱导温度，1.0 mmol/L作为诱导IPTG 浓度，200 μg/mL作为诱导氨苄青霉素浓度，诱导5 h为最佳诱导条件。 3.使用亲和树脂对诱导产生的融合蛋白进行纯化，以CYA为底物，NADPH为辅 酶，对CsANR1和CsANR2融合蛋白活性进行检测，通过HPLC分析酶促反应产物。 结果显示，CsANR1和CsANR2融合蛋白均能催化CYA生成EC，证明它们都具有 茶树ANR酶活性。 4.通过实时荧光定量PCR技术研究了CsANR1和CsANR2基因在茶叶不同发育 阶段的表达量，结果发现它们的表达趋势差异不大，表达量在芽和三叶中最高。 关键词：茶树 花青素还原酶 基因克隆 原核表达 酶活性检 测 Abstract Catechins, as the main component of tea polyphenols and the most important secondary metabolites in tea plant， is also the main chemical component to determine the quality of tea. Study of the function of key genes influencing tea catechins biosynthesis is of great significance for tea breeding and the improvement of tea quality. The study of catechins biosynthesis has been nearly completed, ANR, a key enzyme in catechins biosynthesis was directly related to the synthesis of EC and EGC. Using RT-PCR, prokaryotic expression, HPLC technology, we cloned the two sequences of tea ANR in GeneBank, expressed their proteins, detected enzyme activity and identified the reaction products. The optimal conditions such as inducing time, temperature, IPTG concentration, ampicillin concentration were studied. The ORF sequences of CsANR1 and CsANR2 were cloned by RT-PCR, through the use of DNAMAN, SignalP3.0, SOPMA, SWISS-MODEL Web site, we compared the