发酵普鲁兰多糖的条件优化、菌种选育及中间底物的初步研究-食品科学与工程专业论文.docxVIP

上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 李友荣 华东理工大学 教授 主席 蔡海波 华东理工大学 教授 委员 严维凌 上海市食品研究所 教授级高级 工程师 委员 胡洁云 上海市食品研究所 工程师 秘书 答辩地点 上海市食品研究所 答辩日期 2015.06.05 发酵普鲁兰多糖的条件优化、菌种选育及中间底物的初步 研究 摘 要 普鲁兰多糖是一种天然的、水溶性的胞外多糖。它独特的线性结构使其具有 独特的物理性质，能够应用于诸多领域。因此提高普鲁兰多糖产量才能满足各个 领域对其应用的需求。 本文先从优化发酵工艺条件的角度来提高普鲁兰多糖的产量。利用响应面法 通过 Design-Expert 8.0.6 软件对温度、时间、转速、初始、装液量、接种量这六个 工艺参数进行分析。首先通过单因素实验分别确定温度、时间、转速、初始、装 液量、接种量这六个因素的最适水平范围。随后在前期单因素实验的基础上，通 过 Plackett-Burmen 六因素两水平实验确定时间、转速、初始 pH 为影响出芽短梗 霉发酵产普鲁兰多糖的三个显著因素，其余三因素正效应的取高水平值，负效应 取低水平值。再将三个显著因素进行 Box-Behnken 实验和响应面法分析来确定最 佳的发酵工艺条件。最终确定优化条件为温度 25 ℃，时间 5.5 d，转速 240 r/min， 初始 pH6.6，装液量 30 mL，接种量 2%。优化后的普鲁兰多糖产量达到 26.31 mg/mL， 与预测值 26.68 mg/mL 接近，比初始产量 16.13 mg/mL 提高了 63.1%。 然后再从菌种本身的角度出发考虑来提高普鲁兰多糖的产量。诱变方式可以 分为单一诱变和复合诱变，复合诱变又可分为同一诱变剂的重复使用、两种或多 种诱变剂的先后使用，以及两种或多种诱变剂的同时使用。在本实验中分别利用 紫外单一处理、LiCl 单一处理以及紫外和 LiCl 的复合处理来对出发菌株出芽短梗 霉 IFO4464 进行诱变筛选，并将其进行对比。经过紫外单一诱变后的菌株普鲁兰 多糖的产量大大提升，但黑色素问题没有得到很好的解决；经过 LiCl 单一诱变的 菌株其黑色素问题得到很大改善但普鲁兰多糖的产量却大幅下降；经过 3min 的紫 外和 0.3%的 LiCl 同时诱变后得到的菌株其黑色素得到很大的改善，并且普鲁兰多 糖产量也有了很大的提升达到 40.93mg/mL。综合紫外单一诱变、LiCl 单一诱变和 复合诱变三种方式最终选择复合诱变筛选出的菌株 FAS-01 作为最终的目的菌株， 该菌株达到了本实验的诱变要求，既提高了普鲁兰多糖的产量也大大简化了后期 普鲁兰多糖提取的工序。 最后从普鲁兰多糖生物合成的角度分析，通过研究普鲁兰多糖在发酵过程中 I 的中间底物来为普鲁兰多糖的合成机理提供依据。 本实验部分采用岛津液相色谱 仪，利用示差检测器，在流动相：乙腈：水=7:3；柱温：35 ℃；流速：1 mL/min； 进样量：20 μL 的色谱分析条件下对葡萄糖、果糖和蔗糖的标样进行色谱分析，分 别绘制标准曲线。然后在此分析条件下分别测定依次发酵 1、2、3、4、5 天的发 酵液中葡萄糖、果糖及蔗糖的含量及变化情况。最终研究表明，在此液相色谱分 析条件下能将发酵液中的葡萄糖、果糖和蔗糖很好的分离，可以满足分析要求。 并且在发酵过程中由于只检出果糖和葡萄糖两种峰，因此可以推断在发酵过程中 中间产物中己糖应该只有葡萄糖和果糖。同时该方法可以准确测定发酵液中葡萄 糖和果糖的含量，因此将蒽酮比色法测得的普鲁兰多糖产量减去所测得葡萄糖和 果糖的含量能够得到更加准确的普鲁兰多糖的产量。 关键词: 普鲁兰多糖， 条件优化， 诱变， 中间底物， 高效液相 II Study on optimization of fermentation conditions, strain selection and middle substrates by Aureobasidium pullulans ABSTRACT Pullulan, kind of natural and water solubility exopolysaccharides. It can be used in many fields because of unique physical properties. So a large number of pullulan are needed. This article started from the angle of the optimization of fermentation conditions to improve the production of pullu