供者淋巴细胞输注治疗小鼠H22肝癌的实验研究..docVIP

供者淋巴细胞输注治疗小鼠H22肝癌的实验研宄 ：曾冬香，姜藻，毕延智，张琰 ［ ］目的：观察供者淋巴细胞输注对小鼠H22肝癌 的治疗作用。方法：荷瘤昆明小鼠分荷瘤对照组、5?氟脲嘧 啶化疗组、DLI组及加DL I组4组。比较各组小鼠生存期 抑瘤率及瘤体病理检查结果，检测皿细胞及的活性。结果:B、 C组生存时间长于A组，D组长于C组;B、C、D各组抑瘤率依 次为％、％、％;C、D两组NK细胞及活性明显高于A、B组；病 理观察见C、D组大量炎性细胞浸润。结论:DLI对小鼠H22 肝癌有治疗作用，是一种潜在可行的实体瘤细胞过继免疫治 疗方法。 ［关键词］肝癌；供者淋巴细胞输注;移植物抗肿瘤效应; 免疫治疗;小鼠 随着现代生物技术的发展，生物治疗已逐渐成为治疗肿 瘤的重要手段之一。目前LAK细胞、TIL细胞、TAK细胞等过 继性细胞免疫疗法都是给患者回输其自身的淋巴细胞。本研 究通过向荷瘤小鼠体内输注正常的供者淋巴细胞，诱导特有 的异体抗肿瘤反应来攻击肿瘤，探索一种新的实体瘤过继免 疫治疗方法。 1材料与方法 动物 小鼠、KM小鼠，雌性，均为8?10周龄，体重18?22g， 由东南大学医学院实验动物中心提供。 试剂 环磷酰胺为江苏恒瑞医药股份有限公司产品；5.氟脲嘧 啶为天津金耀氨基酸有限公司产品。 实体型荷瘤鼠模型建立 无菌操作取传代8d的H22小鼠腹水，台盼蓝染色，活瘤 细胞超过9 0%，调细胞浓度为lX107ml_l，分别取接种于 KM小鼠右侧腋下皮下，接种后第3天可触及肿瘤结节。 实验分组 共分4组，每组10只。A组：不作任何处理;B组：接种后 第3天开始化疗，? kg-1腹腔注射，连续用药7d;C组［供 者淋巴细胞输注组］:接种前lid经脾细胞加CP加供体脾细 胞输注的方法［1］诱导对小鼠的特异性免疫耐受状态，接种 后第3、10、17天尾静脉注射供鼠脾脏淋巴细胞，细胞数分 别为X 107、X107及1X107只-1。D组：接种前4d诱导免 疫耐受，接种后第3天开始化疗，方案同B组，第1 0、17、 24天予DLI，细胞数同C组。 观察指标 生存时间记录接种当天开始至小鼠死亡的时间，计算 各治疗组生命延长率。 抑瘤率待瘤结节长出后每天用游标卡尺测量瘤体长 短径，比较瘤体生长情况，计算接种后第15天各治疗组抑 瘤率。肿瘤体积=长径X短径2. 2;抑瘤率=.对照组肿瘤体积 X100%。 瘤体光镜下组织病理学观察接种后第15天各组处死3 只小鼠取瘤体，固定包埋切片，H E染色光镜观察。常规无 菌取脾，制备脾细胞悬液以备检测。 NK细胞杀伤活性检测参照文献［2］的方法略有改动。 取上述已制备的脾细胞悬液4X 106m 1-1，加入96孔培养板， 每孔100P 1，每只小鼠脾细胞设3个重复孔。取传代48h的 H22细胞，调细胞浓度为2X105m 1-1，每孔加入lOOul， 使每孔效靶比为20 : 1。平行设效应细胞对照孔。按MTT方 法加人试剂并测0D值，依下式计算杀伤率： NKCA= [1-.靶细胞对照孔OD值]X 1 00%o 的诱生及其活性检测参照文献[3] T淋巴母细胞增殖 分析法。诱生：取上述已制备的脾细胞悬液5X106ml_l放入 培养瓶，置37°C、体积分数为的C02培养箱中培养40h，离 心收集上清液，置_20°C冰箱保存备用。制备活化的脾淋巴 细胞:无菌取正常KM小鼠脾脏，制成5X106ml-l细胞悬液， 加入ConA使其终浓度为5mg ? L-1，置37°C、体积分数为的 C02培养箱中培养48h，收集细胞，离心洗涤2次，配成5 X105ml-l细胞悬液作为检测的反应细胞。活性检测：将待测 小鼠脾细胞上清液用MTT比色法测定活性。 统计学处理 所有数据采用SPSS统计软件进行分析，结果以_x±s 或百分率表示，两样本均数比较采用t检验。 2结果 小鼠生存情况 各组小鼠100%死亡。A组生存时间d;B、C组生存时间 分别为、d，较A组明显延长;D组小鼠平均生存期上升到d， 生命延长率％，与其他3组相比大大提高。 小鼠肿瘤生长情况 接种后第3天即可扪及瘤结节，A组随即迅速增大，C 组增大速度稍慢。B、D两组用药后3d内肿瘤逐渐缩小，有 些甚至完全消失;B组停药后3d左右肿瘤又逐渐增大;D组肿 瘤复发时间延长至7d左右，再次DLI可控制瘤体生长。接 种后15d各组小鼠肿瘤生长情况见表1。 表1接种后15d各组小鼠肿瘤生长情况 1 ）与A组比较，P A、B、C、D各组NK细胞活性依次为土、土、土和土， 正常小鼠为土。A组NK细胞活性较正常小鼠明显下降，B组 与A组比较差异无显著性，C组NK细胞活性迗正常水平，D 组与其余各组比较均有显著差异。 的产生及其活性 A、B、C、D各组活性依次为土、土、士和士，正常小鼠 为士。