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贝类血细胞分类及其功能的研究进展 　　血细胞是贝类细胞免疫的承担者，直接参与异物的吞噬、包囊、免疫黏附、伤口修复等过程[1]，同时能够合成和释放多种水解酶、抗菌肽、细胞因子类似物、调理素、凝集素等免疫因子，是体液免疫的供给者[2]。 　　关于贝类血细胞的研究开始于1934年，兴盛在上世纪70年代中期，主要研究血细胞的形态、结构、功能，了解贝类的防御机制，以便抵御当时寄生虫和病菌泛滥引起的大量死亡情况[3]。随着研究的深入，学者们所用方法不同导致血细胞的分类命名存在巨大的差异，目前为止，贝类的血细胞分类都没有形成一个统一的标准。本文通过引用国内外相关文献，对目前研究贝类血细胞分类的几种技术方法做出阐述，列举出一些常见经济贝类血细胞的种类名称，并简单介绍其形态、结构及功能，为以后贝类非特异性免疫防御相关研究提供基础。 　　1 贝类血细胞分类研究技术 　　早期的贝类血细胞分类研究主要是通过光学或电子显微镜的直接观察，根据血细胞内部细胞器的形态、颗粒物质的有无以及细胞外部的形态结构、运动方式、血细胞发生等来进行分类。随着组织化学染色方法的成熟和发展，由于血细胞内不同物质对染色剂的亲和性不同而呈现颜色上的差异，为血细胞分类提供了新的研究方法。近些年来，流式细胞术、单克隆抗体及密度梯度离心等新型技术的应用为贝类血细胞的分类提供更多选择。 　　1.1 显微镜观察技术 　　显微镜观察技术分为普通光学显微镜观察和电子显微镜观察。其中，电子显微镜观察又分为透射电镜观察和扫描电镜观察。与光学显微镜相比，电子显微镜是以电子束作为照明源对样品进行透射或反射，在通过电磁透镜的多级放大后成像于荧光屏上。 　　透射电镜具有高分辨率、高放大倍数、成像立体丰富等优点，但由于其成像原理也存在样品制备具有破坏性、电子束直接轰击样品表面、需真空环境及采样率低等缺点。透射电镜观察贝类血细胞这种细胞密度低、易凝集、形态结构多样的悬浮游离细胞时，常规的样品制备条件就不太适合。刘静等[4]从取样方法、琼脂包埋方式和锇酸固定时间等方面找到了适合菲律宾蛤仔血细胞透射电镜的样品制备方法，指出用固定液润洗过的注射器收取血淋巴液能有效防止凝集显现产生，同时采用离心式的琼脂包埋方法能最大限度地减少血细胞的丢失，并且锇酸固定2 h得到的样品制备效果最佳。 　　扫描电镜分辨率高、观察景深大，可直接观察样品的表面结构，图像富有立体感、真实感，除了能显示一半样品表面的形貌外，还能将样品微区范围内的化学元素与光、电、磁等性质的差异以二维图像形式显示出来，并可用照相方式拍摄图像[5]。 　　总之，透射电镜常用于观察普通显微镜不能分辨的细微结构，扫描电镜则主要用于观察物体表面的形貌特征。有时两者配合可以得到较为全面的分析结果。 　　1.2 组织化学染色技术 　　组织化学染色技术是利用一些特殊的染色物质可与细胞的某种成分发生反应而特异性附着颜色的原理，对这种成分进行定性和定位分析的技术[3]。此方法可以通过选择不同的染色剂几乎可以区分细胞内各种成分，如：AB-PAS染色法可以显示糖类；汞溴酚蓝染色法可以显示蛋白质；苏丹黑B染色法可以显示脂肪类；Feulgen染色法显示DNA等等。 　　1.3 流式细胞技术 　　流式细胞术是一种对快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速定性、定量分析或分选的技术，具有检测速度快、测量参数多、采集数据量大、分析全面、分选纯度高、方法灵活等特点，已经成为近代科学研究中的热门[6]。流式细胞仪是以流式细胞术为核心技术，将经过荧光染色的待测细胞制成单细胞悬液，在鞘液的包被下单行排列，以激光束作为激发光源垂直照射单行流动的细胞，对它的散射光和携带的荧光进行探测，从而完成细胞分析和分选。 　　1.4 单克隆抗体技术 　　单克隆抗体技术是依据抗原抗体具有特异性结合的特点，具有特异性的抗体与血细胞膜上抗原决定部位结合而反映出血?胞的不同类别及其免疫功能[7]。 　　1.5 密度梯度离心技术 　　密度梯度离心一般是纯化病毒的一种常用方法[8-9]。原理是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度介质的某些特定位置中而形成不同区带的分离方法[10]。优点是分离出来的细胞或病毒仍有很好的活性，广泛用于组织病理学研究中，近几年在贝类血细胞的分类和功能领域得到应用。以往主要采用氯化铯、蔗糖和多聚蔗糖作为梯度介质进行离心，但由于这几种介质的黏度高时渗透压也会处于较高水平，会对部分分离的目标病毒或细胞产生毒性，因此这种介质纯化出来的病毒或细胞需要进行透析或稀释才能应用于后续研究。张辉等[10]人使用高亲水性、高密度、低黏度的碘克沙醇作为介质进行梯度离心取得良好效果。 　　2 贝类血细胞分类 　　不同学者使