雌激素及雌激素受体α对谷氨酸诱导神经细胞损伤的作用研究-儿科学专业论文.docxVIP

贵阳医学院 贵阳医学院 2013 届硕士研究生论文 临床轮转考核表(按时间顺序) 学术活动情况表(按时间顺序) 临床能力考试及学位答辩情况表 PAGE PAGE 10 雌激素及其受体α对谷氨酸诱导神经细胞损伤的作用研究 专业名称：儿科学 研 究 生：张广云 导 师：王建怡 教授 摘 要 目的 建立 谷 氨 酸（ Glutamate Glu）诱 导 的 神 经 细 胞 损 伤 模 型 ，观 察 雌 激 素 及 雌 激 素 受 体 a（ Estrongen receptor a ERa） 对 谷 氨 酸 诱 导 神 经 细 胞 损 伤 的 保 护 作 用 ，分 析 其 可 能 作 用 机 制 ，希 望 为 进 一 步 认 识 神 经 系 统 相 关 疾 病 的 病 理 生 理 过 程 提 供 理 论 依 据 ，并 为 相 关 领 域 的 治 疗 提 供 新 的 思 路 。 方法 原 代 培 养 皮层 神 经 细 胞 ，神 经 元 特 异 性 烯 醇 化 酶 (Neuron specific enolase, NSE)免 疫 组 化 染 色 方 法 鉴 定 神 经 元 的 纯 度 。建 立 Glu 诱 导 的 神 经 细 胞 损 伤 模 型 ， 通 过 检 测 细 胞 乳 酸 脱 氢 酶 （ Lactate dehydrogenase, LDH） 漏 出 率 以 及 细 胞 凋 亡 率 ， 鉴 定 该 损 伤 模 型 。 用 前 期 试 验 中 已 构 建 成 功 的 ERα 重 组 慢 病 毒 (V-ERa-RFP-flag)， 感 染 Glu 诱 导 的 神 经 细 胞 损 伤 模 型 ，实 时 荧 光 定 量 PCR 和 western blot 方 法 检 测 ERα 转 录 和 蛋 白 相对 表 达 水 平 。 实 验 分 为 3 组： ①对 照 组 ： 空 慢 病 毒 (V-RFP-flag)感染 Glu 诱 导 的 神 经 细 胞 损 伤 模 型 ； ②雌 激 素 组 ： 雌 激 素 干 预 Glu 诱 导 的 神 经 细 胞 损 伤 模 型 ； ③慢 病 毒 组 : V-ERa-RFP-flag 感染 Glu 诱 导 的 神 经 细 胞 损 伤 模 型 。通 过 流 式 细 胞 仪（ Flow cytomety ， FCM ）、 酶 标 仪 分 别 检 测 各 组 神 经 细 胞 凋 亡 率 、 LDH 漏 出 率 以 及 Caspase 3 活 性 ， 观 察 对 比 神 经 细 胞 损 伤 程 度 ； 实 时 荧 光 定 量 PCR 及 免 疫 荧 光 法 检 测 各 组 神 经 细 胞 中 N- 甲基 -D- 天 氡 氨 酸 受 体 1 （ N-methyl- D-asprtate receptor 1, NMDAR1 ）及 Ⅰ型 囊 泡 膜 谷 氨 酸 转 运 体 （ Vesicular Glutamate Transporter of type1, VGLUT1 ） 变 化 。 结果 成 功 原 代 培 养 神 经 细 胞 ， 经 NSE 免 疫 组 化 方 法 鉴 定 神 经 元 纯 度 大 于 90% 。 Glu 诱 导 的 神 经 细 胞 损 伤 模 型 中 神 经 细 胞 凋 亡 率 为 20.68±5.6， LDH 漏 出 率 为 28.9±2.6， 与 对 照 组 相 比 差 异 有 统 计 学 意 义（ P0.01 ）， 该 模 型 构 建 成 功 。 Mol =7 的 V-ERa-RFP-flag 感 染 神 经 细 胞 72 h 后 ， 在 荧 光 显 微 镜 观 察 下 可 见 到 红 色 荧 光 表 达 ， 与 对 照 病 毒 相 比 ， 能 增 加 神 经 细 胞 中 ERα 转录 和 蛋 白 表 达 水 平 （ P0.001）。 与 对 照 组 相 比 ，雌 激 素 组 、慢 病 毒 组 细 胞 凋 亡 率 、LDH 漏 出 率 、Caspase 3 活 性 均 降 低 (P0.05) ， 且 实 时 荧 光 定 量 PCR 结 果 显 示 ， 雌 激 素 组 和 慢 病 毒 组 NMDAR1 和 VGLUT1 基 因 转 录 均 下 调 （ P0.05 ）， 免 疫 荧 光结 果提示 NMDAR1 和 VGLUT1 阳 性 细 胞 数 减 少 （ P0.01）。 结论 原 代 培 养 小 鼠 神 经 细 胞 ，成 功 构 建 Glu 诱 导 的 神 经 细 胞 损 伤 模 型 。 MOI =7 的 V-ERa-RFP-flag 能 有 效 感 染 神 经 细 胞 ，上 调 ERα mRNA 和蛋 白 表 达 。 雌 激 素 、 ERa 能 减