肺炎嗜衣原体假定T3SS效应蛋白Cpn0423、0710在感染细胞中定位的初步研究-免疫学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 10 SDS SDS-polyacrylamide gel eletrophroresis SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳 TE tris/EDTA buffer Tris/EDTA 缓冲液 TBS tris-buffered saline Tris 缓冲盐溶液 TBST tris-tween-20 buffered saline Tris-吐温 20 缓冲盐液 TEMED N,N,N’,N’-tetramethylethylenediane N,N,N′,N′-四甲基胺 Tris tris-(Hydroxymethyl)aminomethane 三羟甲基氨基甲烷 肺炎嗜衣原体假定 T3SS 效应蛋白 Cpn0423、0710 在感染细胞 中定位的初步研究 硕士研究生：周安文 导 师：吴移谋 教授 中文摘要 目的： 评价肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae, Cpn)假定 III 型分泌系统(Type III secretion system, T3SS ) 效应蛋白 Cpn0423 和 Cpn0710 的免疫活性；检测其在 Cpn 感染的人喉癌上皮细胞(Hep-2)中的定位情况；观察 Cpn0423 和 Cpn0710 蛋白 的表达时相，为寻找新的 Cpn 和宿主细胞相互作用的关键效应蛋白奠定基础。 方法： 提取重组质粒 pGEX6p-2/Cpn0423 和 pGEX6p-2/Cpn0710，并转化至表达菌 E.coli BL21 中，IPTG 诱导表达重组蛋白 Cpn0423 和 Cpn0710，利用聚丙烯酰胺 凝胶电泳法(SDS)和蛋白免疫印迹法(Western-Blot)分析和鉴定表达产物；采 用 GST 纯化树脂纯化重组蛋白，并浓缩纯化蛋白，BCA 法测定蛋白浓度；重组 蛋白皮下注射免疫 BALB/c 小鼠，制备 Cpn0423、Cpn0710 多克隆抗体，ELISA 法检测免疫小鼠血清中多克隆抗体的效价，分析重组蛋白的免疫原性；间接免疫 荧光法（Indirect Immunofluorescence Assay, IFA）检测 Cpn0423 和 Cpn0710 蛋白 在 Cpn 感染 Hep-2 细胞 72h 后的定位情况。同时应用 IFA 观察 Cpn0423 和 Cpn0710 蛋白在 Cpn 感染细胞 6h, 12h, 24h, 36h, 48h, 72h, 96h, 120h 后不同时间点表达量的 变化及 Cpn 包涵体形态学上的变化特征。 结果： Cpn0423 和 Cpn0710 重组蛋白在 E.coli BL21 菌中获得高效表达，Mr 分别约 为 41kDa 和 35kDa，对温度、IPTG 和时间等诱导表达条件进行系列的摸索优化 后，获得可溶性表达蛋白；采用 GST 纯化树脂纯化获得纯度在 95%以上的重组蛋 白；重组蛋白免疫 BALB/c 小鼠，间接 ELISA 检测免疫血清特异性抗体，效价分 别为 1:16000 和 1:12000。 Cpn 成功感染 Hep-2 细胞，应用 IFA 检测 Cpn0423 和 Cpn0710 蛋白定位在宿主细胞胞浆，观察了 Cpn 包涵体随时间在感染 Cpn 细胞中 形态学上的变化。 结论： (1) 成功制备并纯化Cpn0423和Cpn0710重组蛋白； (2) Cpn0423和Cpn0710能刺激BALB/c小鼠产生高滴度的特异性抗体，具有较 好的免疫原性； (3) Cpn0423和Cpn0710蛋白定位在宿主细胞胞浆，可能为Cpn分泌性蛋白。 关键词：肺炎嗜衣原体；Cpn0423；Cpn0710；蛋白定位。 本课题受以下基金项目资助： 1. 国家自然科学基金（No. c010902） Preliminary Localization of the Predicted Effector Proteins Cpn0423 and Cpn0710 Secreted Via T3SS of Chlamydophila pneumoniae ABSTRACT Objective: To localize the predicted effector proteins Cpn0423 and Cpn0710 secreted via T3SS in Hep-2 cells infected with Cpn, and evaluate their immunogenicity. To detect the distribution of proteins Cpn0423 and Cpn0710 in Hep-2 cells infected with Cpn. To deserve